生細胞および透過処理細胞におけるミトコンドリア呼吸を評価するための酸素フラックス測定

1. HEK 293T 細胞を高分解能呼吸測定チャンバーに追加する

1. ミトコンドリア呼吸培地MiR05をクリーンなオロボロスチャンバーに加えます。ストッパーを挿入してチャンバーを閉じ、吸引システムを使用してストッパーレセプタクルから余分な媒体を吸い取ります。
2. 部分的な容量置換によってHEK 293T細胞をチャンバーに追加するには、実験細胞濃度100万/mLに達するために必要な細胞ストック懸濁液の容量を計算します。
3. チャンバーからストッパーを取り外します。
4. ピペットを使用して、細胞ストック懸濁液の計算された体積に対応する量のMiR05をチャンバーから除去します。
5. 細胞ストック懸濁液をピペットで完全に再懸濁します。
6. 計算された量の細胞ストック懸濁液をチャンバーに追加します。
   手記： 呼吸測定チャンバーは清潔でMiR05で満たされ、ポーラログラフィック酸素センサーは安定した温度で校正され、基質アンカプラー阻害剤滴定(SUIT)プロトコルは事前にソフトウェアDatLabにロードする必要があります。実験サンプル/細胞濃度は、特定のサンプルまたは細胞の種類によって異なる場合があります。 図1 は、HEK 293T細胞の高分解能呼吸測定の例を示しています。
7. ストッパーを挿入し、チャンバー内に気泡が閉じ込められていないことを確認してチャンバーを閉じます。
   1. ストッパーレセプタクルから余分な液体を吸い取ります。
8. 酸素フラックスが安定するまで待ちますが、通常は約15分かかります。

2. マイクロシリンジの取り扱い

1. マイクロシリンジを準備します。
   1. 滴定する化学物質の種類と容量に基づいて、適切なマイクロシリンジを選択して洗浄します。マイクロシリンジをシリンジラックに置きます。
   2. 気泡が入らないように注意しながら、注射器に充填します。
      手記： 気泡ができた場合は、プランジャーをゆっくりと上に動かし、素早く下に数回動かして気泡を除去します。
2. 滴定する化学物質の必要な量については、SUITプロトコルを確認してください。
   1. シリンジに必要な量より少なくとも1 μL多くシリンジを満たします。
   2. ガラスバレルの目的のマークに達するまでプランジャーを押し、針先に小さな水滴が現れることを確認します(プライミング)。
   3. 滴定を続行する前に、薬品バイアルの壁についた滴を拭き取ってください。

3. SUITプロトコルに従った化学物質の滴定

1. SUITプロトコルで示される化学物質を滴定します。
   手記： 滴定する前に、プロトコルのサイドバーでイベントをクリックして、DatLabイベントウィンドウを開きます。
   1. ガラスバレルの終端がストッパーに接触するまで、ストッパーキャピラリーに針を完全に挿入します。
   2. 薬品をチャンバーに素早く注入します。​
      手記： 注入後、急速で一過性の滴定アーティファクトがO₂ フラックスのスパイクとして現れることがあります(図2A)。
   3. ジギトニンを最終濃度5μg/mLまで添加します。
      注意： デジトニンは飲み込むと有毒です。
   4. イベントウィンドウでOKをクリックして、対応するイベントを設定します。
   5. ストッパーレセプタクルから余分な液体を吸い上げます。
   6. 酸素フラックスが安定するのを待って、少なくとも2分間記録します。
   7. ピルビン酸をチャンバーに加えて、最終濃度5 mMに達します。イベントウィンドウでOKをクリックして、対応するイベントを設定します。
      手記： 次の滴定を遅滞なく実行します。
   8. ピルビン酸の直後にリンゴ酸を加えて、最終濃度2 mMに達します。イベントウィンドウでOKをクリックして、対応するイベントを設定します。
   9. ストッパーレセプタクルから余分な液体を吸い取り、フラックスが安定するのを待って、約2分間記録します。
   10. アデノシン二リン酸(ADP)を最終濃度2.5 mMまで添加します。イベントウィンドウでOKをクリックして、対応するイベントを設定します。
   11. ストッパーレセプタクルから余分な液体を吸い取り、フラックスが安定するのを待って、約2分間記録します。
       手記： ADP添加後、フラックスはゆっくりと増加し続け、安定するまでに最大20分かかります。
   12. シアン化カルボニルm-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)を0.5μM刻みで添加して、最大フラックスに到達します。イベントウィンドウの[OK]をクリックして、各滴定後に対応するイベントを設定します。
       注意： CCCPは飲み込むと有毒です。
       手記： CCCP滴定を高速シリーズ(約1.5分間隔)で実行します。その後の添加でフラックスがさらに増加しない場合は、滴定を中止します。イベントウィンドウ内の各CCCP滴定の名前を、*を累積CCCP濃度に置き換えて変更します。
   13. ストッパーレセプタクルから余分な液体を吸い取り、約2分間記録します。
   14. アンチマイシンAを添加して、最終濃度2.5μMにします。
       注意： アンチマイシンAは飲み込むと致命的です。
       手記： 応答時間はサンプルによって異なる場合があります。
   15. ストッパーレセプタクルから余分な液体を吸い取り、約2分間記録します。
   16. 測定の停止というラベルの付いたボタンをクリックします。

4. データ分析

1. データを分析します。
   1. フラックスプロットの安定部分と代表部分にマークを設定します。
      手記： トレースの分析に滴定アーティファクトを含めることは避けてください(図2B)。
2. トップメニューから [マーク] を選択し、[統計をマーク] を選択します。目的の統計モードを選択し、[クリップボードにコピー]をクリックして、さらに分析するためにデータを転送します。

図 1: HEK293T細胞の高分解能呼吸測定微量のO2 濃度[μM](青い線)および体積特異的O2 フラックス[pmol∙s-1∙mL-1](赤線、機器のバックグラウンドO2 フラックスで補正、滴定によるスパイクは除去されました)。SUIT-002_O2_ce-pce_D007は広範なプロトコルであり、細胞ce1、生細胞の日常呼吸 R の追加が含まれています。+掘り出し、ジギトニン10μg・mLL-1;原形質膜の透過処理(CEからPCE)、残留内因性呼吸 REN。+D、ADP 2.5 mMは残留内因性基質消費を刺激します。+M.1、リンゴ酸 0.1 mM および 1Oct、オクタノイルカルニチン 0.5 mM;F経路OXPHOS容量、1c、シトクロム c 10μM;ミトコンドリア外膜の完全性、2M2、リンゴ酸 2 mM がアナプレロティック N 経路をサポートするテスト。F(N)Pです。3Pおよび4G、ピルビン酸5 mM、グルタミン酸10 mM、FNPへの漸進性活性化。5S、コハク酸10 mM、FNSP。6Gp、グリセロリン酸10 mM、FNSGpP。7U4.5、最適なCCCP濃度4.5μMへのアンカップラー滴定;FNSGpE.8腐敗、ロテノン0.5μM SGpE。9Ama、アンチマイシンA 2.5μM、 rox。10AsTm、アスコルビン酸 2 mM および TMPD 0.5 mM、O2 フラックス オフスケール 121 pmol・sL-1・mLL-1。11Azd、アジド200 mM、化学的背景 chb。 細胞濃度100万/mL、培地MiR05、温度37°C。酸素濃度は、断続的な再酸素化(空気、オープンチャンバー、青い色合い)によって60μM以上に維持されました。

図 2: HEK 293T細胞を用いた基質アンカプラー阻害剤滴定(SUIT)プロトコルを簡略化し、化学的滴定の適切なタイミングを強調しました。(A)は、(B)で削除されている滴定によって引き起こされるスパイクを示しています。チャンバーA(マゼンタ線)とチャンバーB(緑色の線)の体積あたりのO2 フラックスのトレース[pmol∙s-1∙mL-1]を重ね合わせた。細胞(ce1)の添加とルーチン呼吸 Rの測定+ジギトニン5μg・mL-1 を掘り下げて滴定し、原形質膜を透過性化し(ceからpce)、残留内因性呼吸 renを測定します。1PM、ピルビン酸 (5 mM) とリンゴ酸 (2 mM) の密接な配列で添加して、N 経路 LEAK 呼吸 NL を刺激します。2D、ADP 2.5 mMの添加;N経路OXPHOS容量NP。3U5、最適なCCCP濃度への0.5μMステップでの迅速なアンカップラー滴定。NADHにリンクされたET容量NE。4Ama、残留酸素消費量 rox を評価するためのアンチマイシン A 2.5 μM の滴定。細胞濃度100万/mL、培地MiR05、温度37°C