卵巣脂肪パッド移植アッセイ:マウスモデルの卵巣脂肪パッドに細胞を導入するためのIn vivo技術

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 卵巣脂肪パッド移植

>NOTE:各動物手術の間に器具を消毒します。すべての機器を事前に準備して手配してください。右卵巣脂肪パッドへの背側移植は、脾臓を避けるため優先されます。ただし、レシピエントは両方の卵巣脂肪パッドに移植を受ける可能性があります。

1. 同系マウスまたは重症複合免疫不全(SCID/NCr)マウスを初代細胞のレシピエントとして使用します。HIO118細胞などのヒト細胞には、Nod/SCID/γ(NSG)マウスまたはSCIDマウスを使用します。
2. レシピエントマウスに、体重 0.15 mL/10 g の用量で 2,2,2-トリブロモエタノールを 1 回腹腔内注射して麻酔します。動物をアニマルフードの加熱パッドに置き、ペダル反射の喪失(つま先のつま先つまみ)により適切な麻酔を確認します。動物が麻酔下にある間の乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を塗ります。術後の痛みを治療するために、鎮痛剤ケトプロフェンを4 mg / g体重で動物に皮下注射します。
   NOTE:別の方法として、麻酔にイソフルランを使用してください。動物を誘導チャンバーに入れ、酸素流量計を0.8〜1.5 L / minに、イソフルラン気化器を2〜3%に調整します。麻酔をかけた動物をチャンバーから取り出し、マスクからイソフルランを呼吸させ、酸素流量計を0.4〜0.8 L / minに、イソフルラン気化器を1.5%に設定してから、手術を開始します。
3. #40クリッパーで手術部位を剃り、手術部位の2倍の部位から毛を取り除き、ポビドンヨードの3つの消毒スクラブで剃った皮膚を準備し、続いて70%エタノールを注ぎ、滅菌ドレープで覆います。
4. バイオセーフティキャビネットにある解剖顕微鏡で動物を動かします。卵巣脂肪パッドの真上の背内側位置を切開することにより、生殖管を露出させます.
   重要なステップ:正確な皮膚切開は創傷治癒を促進します。メスの使用は、ステップ1.4で推奨されます。
5. 細かい鈍い鉗子を使用して、卵巣脂肪パッドを切開部から正中線に向かって慎重に引っ張り、神経と主要な血管への損傷を最小限に抑えます><。 重要なステップ:出血が発生した場合は、手術を中止し、別の宿主動物への移植を検討してください。
6. 28ゲージの斜めの針の助けを借りて解剖顕微鏡の制御下で、卵巣脂肪パッドに2〜4mmの深さの切開を行い、卵巣の3〜4mm上にあります
   C儀式のステップ:切開部が脂肪パッドの半分だけを通過することを確認します。底面に穴を開けると漏れの原因になります。この手順の後、迅速かつ遅滞なく進めてください。
7. 細胞移植の場合は、シリンジ(30ゲージ針)に細胞-基底膜マトリックス混合物10-20μLを充填し、脂肪パッド切開部に注入します。子宮管移植の場合は、細い鉗子で子宮管を拾い上げ、氷上に保管された10〜20μLの基底膜マトリックスに入れます。0.1-10/20 μL XL目盛り付きフィルターチップ(3 mm短縮)を使用して、組織と基底膜マトリックス懸濁液をピックアップし、脂肪パッド切開部に放出します。
8. 基底膜マトリックスが固化し、生殖管が腹膜に戻るまで5分待ちます。2針の外科用縫合糸で筋肉を閉じ、2つの小さな創傷クリップまたは外科用縫合糸で皮膚を閉じます。
9. 手順1.4〜1.8を繰り返して、PBS基底膜マトリックス混合物を動物の反対側の脂肪パッドに移植します。これはコントロールとして機能します。
   重要なステップ:手術後、麻酔をかけたマウスでは熱損失が急速であるため、動物を加熱パッドの上に置きます。
10. 動物をネイティブケージの加熱パッドで回復させ、麻酔から完全に目覚めるまで動物を観察します。動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒に戻さないでください。
11. 手術後のケージにドライフードに加えて、ケージ内に一握りのプレウェットフードペレットを置きます。必要に応じて術後鎮痛薬を次の数日間適用し、毎日傷を検査します。創傷感染が発生した場合は、承認された動物プロトコルに従って抗生物質を投与してください。手術の10日後に傷口が完全に閉じたら、傷口クリップを取り外してください。