マウス卵巣への卵巣癌細胞の同所性接種:細胞の腹膜播種を研究するための卵巣癌マウスモデルを確立する手順

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 細胞懸濁液の調製

1. ヒト卵巣明細胞癌細胞株
   1. 10%ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン/ストレプトマイシン(ペニシリン:100単位/ mL、ストレプトマイシン:0.1 mg / mL)を含むRPMI-1640培地でES-2細胞を維持します。細胞を37°Cで5%_CO2加湿インキュベーターで培養します。
   2. 対数増殖期の細胞を0.05%トリプシン/0.02%EDTA溶液(トリプシン/EDTA)で採取します。
      1. まず、細胞培養容器から古い培地を取り出し、次にPBS(CaなしのPBS、25 cm 2^、25 cm²、3-4 mL)で細胞を1回洗浄します。
      2. 次に、トリプシン/EDTAの25 cm²あたり1 mLを追加します。.細胞培養容器を回転させて、細胞単層をトリプシン/EDTAで覆います。トリプシン/ EDTAを取り外して廃棄した後、細胞培養容器をインキュベーターに3〜5分間、または細胞が剥離するまで
      戻します。
      3. 顕微鏡で細胞を検査し、細胞が細胞培養容器の表面から離れて浮いていることを確認します。
      4. 新鮮な血清含有増殖培地を添加してトリプシンを不活性化し(25 cm²あたり5 mL)、細胞を再懸濁します。再懸濁した細胞を15mLのコニカルチューブに移します。
      5. 300 x gで5分間遠心分離し、4°Cまたは室温で遠心分離を行います。上清を慎重に取り除き、増殖培地(25 cm²あたり5 mL)で細胞を再懸濁します。
   3. 細胞をカウントし(トリパンブルー排除など)、2 x 10⁸細胞/mLの密度で増殖培地に再懸濁します。懸濁した細胞を氷の上に置きます。
2. 凍結した細胞外マトリックス(ECM)ベースのヒドロゲルアリコートを氷浴で解凍します。
3. 細胞懸濁液をECMベースのハイドロゲルアリコートに1:1の比率で添加し(最終細胞濃度:1 x 10⁵細胞/μLのECMベースのハイドロゲル)、十分に混合します。調製した細胞懸濁液は、使用するまで氷浴に入れます。

2. 細胞懸濁液の同所性接種

>注:手術には専用のスイートは必要ありません。手術は、部屋の独立した活動が最小限の領域にある実験室のベンチトップで行うことができます。層流フードも使用できます。滅菌済みの手術器具を使用する必要があり、はさみを使用して皮膚を切開しないでください。

1. この同所性接種モデルには、8週齢の雌のヌードマウス(BALB/c nu/nu)を使用します。
2. まず、イソフルラン(2〜4%)を吸入してマウスに麻酔をかけます。つま先をしっかりとつまんだときに離脱がないことを確認して、麻酔の深さを確認します。マウスに麻酔をかけた後、必要に応じて乾燥を防ぐために、当たり障りのない滅菌眼軟膏を目に塗布します。
3. 麻酔をかけたマウスを手術ステージに腹を下にして置きます。アルコールとヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブの両方で手術部位を数回消毒します。
4. 右肋骨弓と大腿骨の間の脊椎付近に垂直に2cmの切開を行います。切開部位の周囲に滅菌外科用ドレープを使用します。切開した皮膚表面をクランプで固定して、開口部を維持します.
   手記：リトラクターはクランプの代わりに使用できます。
5. 次に、最初の切開の下の頭頂腹膜に2回目の切開(約1cm)を行い、腹腔を開きます。切開した腹部をクランプします。同側の卵巣と卵管を囲む脂肪組織をクランプでクリップして、腹腔から卵巣を取り出します。卵巣と卵管をガーゼに慎重に置きます。次に、マウスの腹を下にして解剖顕微鏡の下に置きます。
6. 注射の直前に細胞懸濁液をインスリン注射器(1/2 cc、29 G)に入れます。調製した細胞懸濁液(1〜2μL)を卵巣に慎重に注入します。数秒間、針を卵巣内に保持して、ECMベースのヒドロゲルのゲル化を確保します。ゲル化後、注入された腫瘍細胞は卵巣内に残ります。
7. 卵巣を慎重に体内に戻します。滅菌された医療用シルクで2番目の切開部を縫合し、次に創傷クリップで皮膚を密封します。
8. 手術後、マウスには鎮痛剤(メロキシカム、筋肉内または皮下、0.2 mg / kgなど)を最初の24時間投与します。