ニワトリ絨毛尿膜血管系への癌細胞の静脈内注射:癌の浸潤と転移を研究するための絨毛膜膜癌モデルを確立する手順

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. がん細胞の注射用調製

>注:転移性コロニー選択は、蛍光がん細胞によって確立された表現型に基づいており、緑色または赤色の蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質でタグ付けされた発現ライブラリまたはベクターに由来します(図1Aの画面全体のフローを参照)。蛍光タンパク質を一過性にトランスフェクトした細胞や、細胞透過性蛍光色素で標識した細胞は、がん細胞の増殖や染色ムラによるシグナルの急速な退色のため、使用することは推奨されません。

1. 注射時にがん細胞を60〜70%のコンフルエント度まで培養します。がん細胞をより高い密度で使用すると、がん細胞の生存率が低下し、転移性コロニー形成の効率が低下します。マイコプラズマ汚染はニワトリ胚の生存率を低下させる可能性があるため、使用するがん細胞がマイコプラズマを含まないことを確認してください。
2. 細胞を1x PBS、pH 7.4で2回すすぎます。残りのPBSを除去し、0.5%トリプシン-EDTAを添加し、すべての細胞が培養皿表面から浮き上がるまで37°Cで2〜5分間インキュベートします。
3. 細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移し、室温で200 x gの5分間細胞を遠心分離します。
4. ステップ1.3と同様に、細胞をPBSの10mLに再懸濁し、再度遠心分離して、トリプシンおよび抗生物質などの他の培地成分を除去する
   手記：がん細胞懸濁液中にトリプシンや抗生物質などの細胞培養成分が存在すると、ニワトリ胚の生存率が低下する可能性があります。
5. 上清を慎重に吸引し、氷冷したPBS1 mLで細胞を再懸濁します。
6. 血球計算盤またはその他の利用可能な細胞計数装置を使用して細胞数をカウントします.
   手記：このスクリーニングプロトコルでは、各転移性コロニーが単一の細胞によって開始されることが必要です。細胞をカウントするときは、細胞が完全にトリプシン化され、単一細胞懸濁液として存在する(細胞塊が存在しない)ことを確認してください。
7. 静脈内(IV)注射の場合、細胞を0.5 x 10⁶ – 1.0 x 10⁶細胞/mLに濃縮します。氷冷した1x PBSを使用して、細胞濃縮物を希釈および/または再懸濁します。10個の胚ごとに約1mLの細胞懸濁液が必要になると予想してください
   手記：懸濁液中の必要な細胞懸濁液濃度は、主に実験者の経験レベルによって決まります。詳細については、次のセクションを参照してください。

2. 転移性コロニー形成のためのがん細胞の静脈注射

>注:このプロトコルに従うと、1日以内に最大100個の胚を注入できます。一般に、転移性コロニーを分離するには、がん細胞を注入するよりも時間がかかるため、すべてのステップを完了するために必要な時間を見積もるために初期実験を行うことが推奨される。がん細胞の蛍光標識を鑑別することで、動物の数を減らし、各実験に必要な時間を短縮することができます。例えば、対照細胞はRFP(赤色蛍光タンパク質)で標識でき、変異腫瘍細胞はGFP(緑色蛍光タンパク質)で代替的に標識することができます。この場合、各実験には、胚間の変動を補正するコントロールが組み込まれています。

1. 図1Bに示すように、注入装置を組み立てます。まず、シリンジに針を取り付け、次に長さ3〜5cmのチューブでシリンジ針を伸ばします。
2. 細い鉗子(幅20~60μL)を使用してホウケイ酸針の先端を折ります。
3. シリンジにがん細胞懸濁液(50〜200 μL)をロードし、ホウケイ酸針をチューブに挿入します(図1B)。
4. ホウケイ酸針に細胞の目詰まりや気泡がないか点検します。各転移性コロニーが単一細胞によって開始されるように、細胞を単一細胞懸濁液として注入することが重要です
   手記：がん細胞は、トリプシン処理後1〜2時間以内にPBSに凝集する傾向があるため、注射の直前に準備する必要があります。必要に応じて、注射に使用する1mLシリンジ(ホウケイ酸針なし)を使用して、細胞を定期的に再懸濁することができます。
5. 毛細血管内に細胞の詰まりが認められた場合は、毛細血管を取り外して細胞を再懸濁し、新しい毛細血管と交換してください。プランジャーを使用して、気泡を押し出します。細胞の目詰まりや気泡が観察されない場合は、次の手順に進みます。
6. カバーの蓋を外し、ステレオスコープの下に胚を移植します。CAM表面に注入する適切な静脈を特定します。静脈と動脈は、CAM組織内に複雑なネットワークを形成します(図1C)。静脈は、酸素が豊富な血液を胚に運ぶため、明るい赤色が特徴です.
   手記：一般的な胚操作、がん細胞の注入、転移性コロニー切除には、0.8倍と1.5倍の対物レンズと10倍の接眼レンズを備えた蛍光実体顕微鏡を使用して視覚化します。これらの手順には、ユーザーの経験レベルに応じて、あまり進歩していない顕微鏡もうまく使用できます。読者は、より詳細な推奨事項について著者に連絡できます。
7. 細胞を注入するのに理想的な静脈を見つけるのは、通常はホウケイ酸針先の直径よりわずかに幅が広く(10〜20%)、胚と計量皿壁の中間に位置するものです。一般的に、静脈分岐部のすぐ隣のポイントに注入する方が簡単です.
   手記：より大きな静脈への注射は簡単に見えるかもしれませんが、過度の出血と胚の生存率の低下につながります。
8. 針の先端を血管壁に押し付け、血流と同じ方向にやさしく圧力をかけます。必要に応じて、綿棒(もう一方の手で持ったもの)を使用して、注入する血管を固定または安定させます。
9. シリンジプランジャーを静かに押し下げます。がん細胞の懸濁液が血流に入るときに血管が「きれいになる」のを観察することで、注射が成功したことを視覚化できます。
10. 目的の懸 ?? 液量が静脈の血流に注入されるまで、シリンジプランジャーを2〜10秒間押し続けます。.全体として、単一の胚の注入には、ユーザーの経験レベルに応じて1〜10分かかる場合があります。注入部位に過度の出血または透明な液体の蓄積が現れた場合は、胚を廃棄します.
    手記：胚を「過剰注入」するのは簡単です。留意すべき一般的な考慮事項は、転移性コロニーは4〜5日の成長期間後に互いに接触してはならないということです。理想的には、末端CAM静脈の毛細血管の~5〜10%は、注射が成功した後に細胞が固定化されている必要があります(図1D、E)。セクション1で述べたように、さまざまな細胞濃度(0.5 x 10⁶ – 1.0 x 10⁶細胞/mL)を使用できます。濃度が低いほど、注入時間が長くなりますが、針の詰まりは減少します。高濃度では、注入時間が短くなりますが、針の詰まりが増加します。オペレーターにとって最も快適な濃度を見つけるために、いくつかの濃度を試すことをお勧めします。一般に、注入時間を短縮するために、高濃度(1.0 x 10⁶ cells/mL)が好まれます。
11. CAMから針を取り外し、綿棒で注射部位を軽くたたいて、血液や余分ながん細胞を取り除きます。
12. 秤量皿の胚を蓋で覆い、注入した鶏の胚をインキュベーターに戻します。
13. すべての胚が注入されるまで、次の胚で手順を繰り返します。

図1:がん細胞注射と転移性コロニーの単離の概要(a)ニワトリ胚スクリーニングプラットフォームのステップを概説するフローチャート。(B)実体蛍光顕微鏡ステージ上に設置したがん細胞注入。(C)がん細胞のCAM血管系への注入。(D)がん細胞注入成功(許容可能ながん細胞密度)を示す画像(注射直後の画像)。(E)過剰注入された胚として見られる、貧弱な癌細胞注射を示す画像。毛細血管にがん細胞が蓄積していることに注意してください(白い矢印)。スケールバー= 1 cm。