グリコーゲン分岐の程度を測定するためのグリコーゲン分岐アッセイ

1. グリコーゲン分岐の定性的評価

1. 飽和塩化カルシウム溶液を調製するには、74.5 g の無水塩化カルシウムを ~40 mL の水に加えて攪拌します。もう少し水を加えて、かき混ぜ続けます。水で最大100mLの容量にし、CaCl₂が完全に溶解するまで攪拌を続けます。
2. 15 mLチューブに50 μLのKI/ヨウ素ストック溶液と13 mLの飽和CaCl₂溶液を混合して、ヨウ素/CaCl₂カラー試薬のワーキングストックを調製します。よく混ぜ合わせ、光から保護して4°Cで保存します。溶液は、これらの条件下で少なくとも1週間安定です。
3. 分岐の決定
   1. 1.5 mLのチューブに、650 μLのヨウ素/CaCl₂色試薬ストックと100 μLの水を混ぜ合わせ、よく混ぜ合わせます。溶液を使い捨てメタクリレートキュベットに移します.
      手記： キュベット内の溶液は透明で淡黄色でなければなりません。
   2. 分光光度計にセットし、波長走査モードで実行して、330 nmから800 nmの背景スペクトルを収集します。
   3. 1.5 mLのチューブに、650 μLの作業用ヨウ素/CaCl₂色試薬と50 μgのオイスターグリコーゲンを混ぜ合わせます。最終容量を水で750μLにし、よく混ぜます。溶液を使い捨てメタクリレートキュベットに移します.
      手記： キュベット内の溶液は透明で、濃いオレンジ/茶色でなければなりません。
4. 分光光度計にセットし、330 nmから800 nmまでの吸収スペクトルを収集します。
5. 50 μgのアミロペクチンと30 μgのアミロースで手順1.3.3から1.4を繰り返します.
   手記：アミロペクチンサンプルは黄/緑、アミロースサンプルは緑/青である必要があります。両方のサンプルが透明である必要があります。形成された着色錯体は安定しており、室温で少なくとも1時間の間、吸収スペクトルに変化はありません。
6. 特性が未評価のグリコーゲンサンプルの分岐構造を示すには、25 μgから50 μgのグリコーゲンと650 μLの作動用ヨウ素/CaCl₂色試薬を組み合わせます。上記のように進め、容量を水で750μLにし、十分に混合し、メタクリレートキュベットに移します。
   手記：グリコーゲンサンプルは、存在するグリコーゲンの分岐の程度(外鎖の長さ)に応じて、黄色/オレンジ色からオレンジ色/茶色になるはずです。繰り返しになりますが、サンプルは透明である必要があります。
7. 吸収スペクトルを収集します。