後根神経節外植片の生成と解離細胞培養

1. 成体マウスからのDRGの外植片培養

1. 収集したDRGを、3 mLの氷冷無血清培地(SFM)を含む35 mmシャーレに入れます。.
2. 個々のDRGを乾いたガラスのペトリ皿に移し、手術用顕微鏡下で、ブレードを使用してDRGに付着したままの余分な繊維と結合組織をきれいにして切り取ります。DRGは、白い脊髄の神経/根に沿って膨らんだ透明な構造として簡単に識別できます。DRGの周囲には血管がよく見られます。
3. 洗浄したDRGを、氷のように冷たいSFMメディアが入った新しいペトリ皿に入れます。
4. ゼラチン状タンパク質混合物(材料の表を参照)を氷冷SFM(1:1)で希釈します。
5. 10/20 μLのゼラチン状タンパク質混合物でプレコートした12ウェルプレートにDRG ex vivoをプレートし、インキュベーター内に37°Cおよび5%CO2で30〜60分間セットします。
6. 1.5〜2 mLのSFMを培養システムに穏やかに加え、外植片全体を覆い、外植片を培養条件(37°Cおよび5%CO2)に維持します><。 手記：DRGは重合ゼラチン状タンパク質混合物によってのみガラス皿に固定されるため、これは重要なステップです。重合時間とピペッティングのスキルは、浮遊を避けるために重要です。
7. DRGを成長させる媒体を72時間ごとに交換し、必要なだけDRGを成長させます。

2. DRGからのシングルセルニューロンの分離

1. 1.25 mg/mLのコラゲナーゼIVを含む1.2 mLのF12培地と共に、1.5 mLの滅菌チューブに収集したすべてのDRGを入れ、37°Cおよび5% CO2で45分間インキュベートします。最初のインキュベーション後、この手順をさらに45分間繰り返します。
2. コラゲナーゼIV処理の直後に、トリプシン(0.025%)を含む2 mLのF12培地で外植片を37°Cおよび5%CO2で30分間処理します。
3. ウシ胎児血清(FBS;33%)を含む2 mLのF12培地と37°Cおよび5%CO2で15分間インキュベー
トします。
4. 外植片を2mLのF12培地で3回洗浄し、培地が曇るまでガラスピペットで機械的に解離します
   手記：この手順には、前のセクションで説明したように、動物からクリーニング/トリミングされたDRGの収集が含まれます。外植片の機械的解離を行うときは、こぼれたり作業材料が失われたりする可能性があるため、穏やかで、過度の力を加えないでください。
5. 解離した細胞培養物を0.22 μmフィルターでろ過し、不純物や過剰な結合組織を除去します。ろ過した細胞ライセートを(2,500 x g)で2分間遠心分離します。
6. 上清を取り除き、神経細胞培養用サプリメント(1x)、抗生物質混合物(1x)、L-グルタミン酸(0.5 mM)、神経成長因子(5 μg/mL)を含む500 μLの神経基礎培地に細胞ペレットを再懸濁します(材料の表を参照)。
7. 解離した細胞をラミニン被覆カバースライド(50 μg/mL;材料表を参照)に、お好みの細胞密度でプレートします。セルカウンターを使用してセル密度を決定します。
   手記：細胞を25,000細胞/カバースライドで播種しました。この技術により、ニューロンとグリア衛星細胞の両方の解離が可能になります。偽単極ニューロンと共培養されたグリア成分は、ニューロンの生存に重要な役割を果たします。