マウス海馬におけるシータ振動のin vitro記録

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。                                                                                     

>1. 急性海馬の体外試料

>注:無傷の海馬調製物を分離するには、3つの主要なステップが含まれます:(1)溶液と機器の準備、(2)海馬の解剖、(3)内因性シータ振動の生成に必要な高速灌流速度システムの設定。このプロトコルでは、分離された海馬が非常に緻密でありながら繊細な製剤を構成しているため、in vitroでの構造の機能的接続性を維持するためには細心の注意が必要であるため、解剖から記録までの手順をタイムリーに実行することが特に重要です。すべてを事前に準備することで、細胞の損傷を最小限に抑え、生理学的機能を維持するために、できるだけ早く適切なレベルの灌流が利用可能になります。

1. ショ糖ベースの人工脳脊髄液(aCSF)溶液
   1. 解剖および解剖後のインキュベーションに使用する1Xストックスクロース溶液を調製します。CaCl ₂を除く表1に記載されているすべての成分を1 Lの脱イオン水に混ぜ合わせ、4°Cで最大2週間保存します。
2. 標準 aCSF ソリューション
   1. 電気生理学的記録中に単離された海馬の高流量灌流のために、標準的な aCSF を調製します。濃縮(5X)ストックをaCSFにするには、CaCl ₂を除く表2に記載されているすべての成分を2 Lの脱イオン水に溶解し、4°Cで保存します。
3. 機器を準備します
   1. 解剖を開始する前に、氷で満たされたプラスチックトレイ(30 x 20 x 5 cm)、カルボゲン接続チューブライン、および3つのガラス製ペトリ皿(10 x 2 cm)でベンチエリアを設置します(図1を参照)。
   2. 500 mLのビーカーに300 mLのショ糖溶液(1X ストック)を加え、カルボゲン(95% O₂、5% CO₂)で泡立て、Ca₂+ [1.2 mM]を加えます。
   3. このショ糖溶液60mLをガラスのシャーレに移し、室温で放置します。残りを4°Cの冷凍庫に10〜15分間入れます。
   4. 解剖全体を通して、氷のように冷たいショ糖溶液をカルボゲンで泡
   立てます。
   5. 2番目のシャーレ(冷蔵チャンバー)にショ糖溶液(4°C)を満たし、氷の上に保ちます。
   6. 50mLのビーカーに30mLの氷冷ショ糖溶液を加えます。.

>2. 全海馬解剖

>注:分離された海馬を解剖する方法は、最初に開発および説明された方法と基本的に同じですが、灌流速度と記録技術に関する追加の詳細と変更があります。

1. 脳の解剖
   1
   1. mLのイソフルラン(100%)をケージに加えた小さなペーパータオルで、ヒュームフードの下でマウスに麻酔をかけます。
   2. 麻酔をかけたマウスの首を切り、頭を氷冷したショ糖溶液(50 mLビーカー、~5秒)にすばやく沈めます。ペーパータオルに転写します。
   3. メスを使用して内側の皮膚切開(尾側から吻側)を行い、側面の皮膚を押して頭蓋骨を露出させます。
   4. 小さなハサミで頭蓋骨を切り開き、へらを使って脳をすばやく抽出し、氷のように冷たいショ糖溶液が入ったペトリ皿に落とします。脳が冷えるまで1〜2分待ちます。
   5. 脳が回復している間に、2〜3 mLのショ糖溶液をレンズ紙で覆われた氷の上のペトリ(解剖)皿に加えます。.
2. 海馬の分離
   1. 脳を解剖皿に直立させて置きます。
   2. カミソリの刃で小脳と前頭皮質を取り除きます。中矢状面に沿って脳を半分に切り、2つの孤立した半球を保持室に戻します。回復のためにさらに1〜2分待ちます。
   3. 片方の半切除した脳を直立させて解剖皿に置きます。
   4. 中矢状構造が観察者に面し、中隔複合体の埋め込まれた輪郭が視床の前方にある組織の薄い洋ナシ形の層として見えるまで、皿を回転させます。
   5. マイクロスパチュラで半角切除した脳をしっかりと保持し、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)でコーティングされたヘラの小さい方の端を中隔領域のすぐ後ろ(尾側)に配置します。
   6. コーティングされたヘラを中隔の下に挿入し、解剖皿に到達するまで先端を下に動かします。中隔領域を尾側でつなぐ繊維を切断します。中隔の前縁に沿って同じ操作を繰り返し、脳の前部につながる繊維を切断します。
   7. ヘラが海馬のすぐ上にある皮質の内側を直立位置で軽く保持し、マイクロヘラを使用して、視床、視床下部、および残りの脳幹核を慎重に引き下げます。次に、へらを使って引き抜かれた組織を切り取り、取り除きます。
   8. 孤立した半球を横にして、海馬の輪郭を特定します。
   9. コーティングされたヘラを背側海馬の吻側端の下の側脳室に挿入します。
   10. へらを半切除された脳の中矢状面と水平に揃えて保持し、先端が尾側に現れるまで心室壁の滑らかな輪郭を滑り込
   ませます。
   11. へらを海馬の下に保持し、海馬が上にある皮質と結合する内側の層に沿って接続繊維に軽く押し付けます。この層の外側にマイクロスパチュラを適用し、コーティングされたヘラに対してスライドさせて、接続繊維をスライスします。
   12. 抽出を完了するには、解剖皿を回転させ、コーティングされたヘラを腹側海馬の下に挿入します。皮質のひだの内側をへらで軽く保持し、マイクロヘラに対してスライス動作を使用して嗅内接続を切り取ります.
       手記：中隔海馬複合体全体は、コーティングされたヘラを海馬全体の下に配置し、その下に残っている脳組織を引き抜くことで除去できます。
   13. 分離が完了したら、海馬を皿の上に置いたまま、氷のように冷たいショ糖溶液を一滴加えて冷たく保ちます。残っている皮質と繊維を慎重に切り取り、円蓋にカミソリの刃を優しく当てて海馬を中隔から分離します
       手記：錐体細胞からパッチクランプ記録を行う場合、単離された海馬を横方向に45°の角度で切断して、海馬の残りの部分のローカルネットワーク回路を損なうことなく、Cornu Ammonis(CA)1の錐体層を露出させることができます(「アングルカット」調製)。
   14. 調製物を室温のショ糖溶液に移し、15〜30分間回復させてから記録チャンバーに移します。

3. 孤立した海馬を記録するための高速灌流を設定する

1. 重力供給灌流システムを設置し、20 - 25 mL/minで酸素化aCSFの連続高速流入を可能にします。
   1. 事前に aCSF (1X) フラスコを準備し、実験開始の少なくとも 15 分前に加温浴 (~30 °C) に浸してください。インライン溶液ヒーターシステム(30°C)をオンにします。
   2. カルボゲンタンクに接続された水槽用バブラーとチューブラインを使用して、実験全体を通してaCSFを酸素化し、灌流開始前にCaCl₂ [2 mM]を添加します。
   3. CSFの流れを止め、ガラスピペットの広い端を使用して海馬を記録チャンバーに移します。スクロース飽和製剤を沈め、底に沈殿させます。
   4. 調製物を記録チャンバーの中央(入口-出口軸に沿って)に置き、CA1とSUBの滑らかな表面を上にします。
   5. 中隔肢と側頭部で小さなウェイトで海馬を安定させ、aCSFの流れを再開します。

4. 孤立した海馬の電気生理学

1. in vitro海馬シータ振動の細胞外記録
   1. in vitroで単離された海馬からの局所電界電位(LFP)または単一ユニット活性の細胞外モニタリングには、aCSFを充填したガラスマイクロピペット(1〜3MΩ)を使用します。ゲインx1000のパッチクランプアンプ、0.1〜500Hzのオンラインバンドパスフィルタリング、および5〜20kHz.
      のサンプリングレートを使用して、低ノイズAC結合電界電位信号を録音します 手記：このプロトコルで使用されるカスタムメイドの顕微鏡には、海馬の低倍率ビューのための低倍率(2.5倍)および高倍率(40倍)の対物レンズと、シングルセル認識のための赤外ビデオ顕微鏡法および落射蛍光法が装備されています。このシステムのコンポーネントには、正立蛍光顕微鏡、蛍光フィルターキューブ、アナログビデオカメラ、イメージングソフトウェア付きデジタルフレームグラバー、ステージ上のカスタム灌流チャンバー(図2A、挿入図i)、ニューロン記録と光ファイバー配置用の高精度マイクロマニピュレーターが含まれます。
   2. 顕微鏡に取り付けたカメラをパソコンのディスプレイに接続して、低倍率(2.5倍)で海馬の準備物を検査し、外面にアンダーカットや損傷がないことを迅速に確認します。CA1 の滑らかな表面に沿った肺胞線維の斜め方向に配置された配置は、海馬を通して透過光を照らすときに見えるはずです (図 2A、挿入図 ii)。
   3. 低倍率の広視野対物レンズを使用して、孤立した海馬と特定の記録位置でのLFP電極の配置を表示します.
      手記：異なる記録位置に複数の電極を配置した単離された海馬調製物のレイアウトを図2Aに示します。
   4. LFP電極をCA1領域の表面(肺胞)に接触するまで浴に下げます.
      手記：これにより、通常、電極が記録媒体に接触したときに発生するのと同様に、AC結合記録に高速トランジェントが生成されます。オーディオモニターは、この手順の後にLFPチャネル信号を聞くのに役立ちます。
      手記：多くの場合、活動の初期の兆候は10〜15分後にのみ現れるため、準備にすぐに進まないようにすることが重要です。この期間を過ぎても表面のLFP電極が活性を拾わない場合は、層のオリエンスを少し下に進め、定期的に一時停止して、主要な細胞層に近づくときに何らかの活動が生じるかどうかを確認します。さらに5〜10分経っても何も検出されない場合は、電極を慎重に引っ込めて、同じ領域に沿って別の場所に置きます。
   5. LFP電極をピラミッド層に送ります。細胞外スパイク活性は、個々のニューロン(主に錐体細胞および抑制性バスケット細胞)からの単一ユニット放電が検出されると、最初に増加することを観察します。電極をさらに下げると、先端が橈骨に交差すると、スパイクが再び消え始めることに注意してください。シータ周波数範囲(4 - 12 Hz)ではっきりと見えるネットワーク振動が明らかになり、記録位置が放射状に下がるにつれて最大振幅(~100 - 300 μV)に達することを観察します。
2. 1つの領域にわたるシータ振動
   1. CA1領域を横切る自発的なシータ振動の空間特性をテストするには、参照LFP電極の先端を内側のCA1サイト(縦中隔側頭軸に沿って内側に位置する)に配置し、前述のように半径方向に下げます。
   2. 2 番目の LFP 電極を CA1 サイト (最初の LFP から 200 - 800 μm の中隔または時間) に配置し、CA1 θ 振動が比較的長い距離で同期できることを確認します。
3. 層間のシータ振動
   1. 海馬層全体のシータ振動の特性をテストするには、CA1ラジアタム部位に参照LFP電極を残します。層のオリエンスの真上から始めて、2番目の電極を錐体細胞層に下げ、橈骨を通します。ピラミッド層全体でLFP信号が徐々に反転する(相対位相反転)ことを観察します。
      手記：これらのタイプのアクティビティの代表的な例については、図 2B を参照してください。孤立した海馬の相逆転の部位を示す層流/深さプロファイルと電流源密度(CSD)解析の例は、以前に発表されています。

>表 1.

テーブル2.

図1:単離された無傷の海馬調製のための解剖手順。

(a) 解剖設定の一般的なビュー。右上:カルボゲン化氷冷ショ糖溶液フラスコ(1);左下:レンズペーパー(3)で覆われた解剖皿を保持している氷で満たされたプラスチックトレイ(2)。ショ糖溶液(4)を含む冷蔵チャンバー。そして手術器具のセット(5)。(b)解剖皿上の半解剖前のマウス脳の眺め。(c)コーティングされたヘラの小端を中隔の下に挿入する前に、冷蔵保持室および左脳半球のズームビュー(挿入図)で半切除された脳の回復。(d)CA1 / SUB領域に沿って孤立した海馬の下に配置されたコーティングされたヘラを、残りの脳組織とともに下から引き出します。

図2:水中記録チャンバー内の無傷の海馬調製物からのin vitroシータ振動を記録するためのセットアップの構成。

(a) 孤立した海馬は、海馬領域のレイアウトと、中隔的に分布した4つの異なる記録部位に配置された複数の電極で示されています(白いアスタリスクで示されています)。上に示した記録チャンバープラットフォームの図(挿入図i)では、高速灌流の入口と出口が番号(1、2)で示されています。下図の海馬の拡大画像(挿入図ii)では、中側頭型CA1に1つの電極が配置されており、歯槽の線維が亜眼球に向かって斜めに走っていることが容易に見えます。S:中隔、T:側頭、f / fx:線毛円蓋。(b)CA1層の構成の概略図と、層状層(灰色)と層radiatum(黒)から同時に記録された代表的なLFPトレース。2 つの層間の信号の逆位相に注意してください。Alv:歯状体層、PR:ピラミッド層、SR:橈骨層。SLM:Stratum Lacunosum Moleculare。(c)フィルタリングされていない信号からのCA1/SUB領域(20秒セグメント)および2秒拡張セグメント(下)から記録された自発的なシータ振動を示すLFPトレースの例。シータ周波数(0.5 - 12 Hz)のバンドパスフィルタリング。遅いガンマ(25-55 Hz);高速ガンマ(125〜250 Hz)。