成体のショウジョウバエにおける貫通性外傷性脳損傷の誘発

1. 貫通性外傷性脳損傷 (PTBI;図1)

1. 新しく閉じたF1フライを並べ替えます。卵閉後6時間以内の若い男性を選択します。これらのオスを、バイアルあたり40匹以下のハエがいる、食物が入ったきれいなバイアルに入れます.
   注:これは、午前中にCO₂パッドでハエを麻酔し、腸内に胎便(腹壁を通して濃い緑がかった斑点として見える)がまだ残っている成人男性を特定することで、最も簡単に達成できます。
2. 70% エタノールで満たされた 1.5 mL の微量遠心チューブに ~100 本のピンを入れて、Minutien ピン (材料の表を参照) を少なくとも 5 分間消毒します。
3. CO2パッドと絵筆に70%エタノールをスプレーして消毒し、清潔で糸くずの出ないティッシュで拭いて乾かします。ツールが清潔で乾いたら、40個以下の選別されたF1オスをクリーンパッドに戻します。
4. フライパッドでF1の男性を2つのグループに分けます。1つのグループは、無傷のハエのコントロールとして機能します。2 番目の実験グループは PTBI を受けます。
5. 鉗子を使用して、4〜5個の新しいMinutienピンをマイクロ遠心チューブから引き出し、CO₂パッドの端近くに配置します。解剖スコープの下で、鋭い先端を持つまっすぐな微細ピンを選択します.
   注:実験に1つのMinutienピンを使用すると、ばらつきが減少します。鋭利なピンを再利用します。損傷したピンまたは鈍いピンは、安全に廃棄するために70%エタノールが入った別の1.5mL微量遠心チューブに入れます。
6. 標準クロスのハエを扱う場合は、緑色蛍光タンパク質(GFP)用の適切な励起フィルターと発光フィルターを備えた実体顕微鏡発光ダイオード(LED)ランプのスイッチを入れてください。これにより、440-460 nMでの励起が可能になり、500-560 nM.
   の可視化が可能になります。 注:このランプとフィルターセットを使用すると、キノコ本体の細胞体は頭のキューティクルを通じて緑色に蛍光を発します(図1C)。パーマツインフライまたは他の遺伝子型のハエの場合、実体顕微鏡用の標準的な白色光イルミネーターを使用して、キノコの体への損傷を標的にするための頭部キューティクル上のランドマークを視覚化できます(図1C)。
7. 鉗子を使用して、選択したミヌーティエンピンを片方の手で(右利きの人の場合、これは通常右手です)持ち、もう一方の手(通常は左)で絵筆を拾い上げて保持します。実験グループからハエを選び、ハエの頭が右側にある頭部カプセルの背側が見えるようにハエを配置します。ブラシを背側胸部の前方に置き、フライを安定させるためにゆっくりと押し下げます。
8. 頭の右側にあるキノコ体の細胞体にミヌーティエンピンの先端を向け、頭のカプセルを貫通します。ランドマークを使用する場合は、眼球と眼の背縁の間にある背側の頭のキューティクルをターゲットにします(図1)。
9. 怪我をした後、絵筆を使って頭をミヌーティアンピンからそっと押します。
10. RNA-SeqまたはqRT-PCRに脳を使用する場合は、頭の左側に2回目の損傷を与えます。
11. 手順2.8〜2.10を繰り返して、実験グループのすべてのハエを傷つけます。
12. すべてのハエが負傷したら、対照群と負傷したハエを、食品が入ったラベル付きの別々のバイアルに入れます。ハエが麻酔から回復するまで、およびその後の老化中にハエが食品に引っかかるのを防ぐために、バイアルを水平(つまり、横向き)に置きます。
13. 標準的なクロスフライを25°Cに置き、パーマツインフライを30°Cに置いて熟成させます。
14. 24時間以上経過したハエの場合は、1〜2日ごとに清潔な食品の上に置いてください。

図1:成体のショウジョウバエ中枢脳への貫通性外傷性脳損傷(PTBI)。(A)成虫のフライヘッドの外観の概略図。正面図です。したがって、動物の右側は視聴者の左側にあります。(B)灰色で示された損傷の軌跡を持つ成虫のショウジョウバエの頭部の内部の概略図。これは後面図です。したがって、この画像とそれに続く図では、脳の右側が右側にあります。中枢脳PTBIは、キノコ体(緑)や脂肪体(青)や血球(赤)などの脳外の組織など、複数の脳構造に影響を与えます。CB = 脳中枢領域。OL= 視葉領域。(C)キノコの体(矢じり)が緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識されている生きた成体の頭部の背側図。これが「標準遺伝子型」です(詳細はテキストを参照)。PTBIプロトコルは、キノコの体に損傷を与える再現性があります。