単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

1。 FRETイメージング顕微鏡のセットアップ

原則的には、研究室で利用可能で、カメラポートを持つ任意の倒立蛍光顕微鏡は、イメージングをFRETに適合させることができる。顕微鏡、追加のシャッターの有無にかかわらず、光源、放出光とCCDカメラ（ 図1を参照）のために、ビームスプリッタ：最終的なセットアップは、以下の重要なコンポーネントを含める必要があります。ハードウェアデバイス、特に光源、シャッター、カメラに統合されており、画像収集と分析を行うことができ、イメージングソフトウェアによって制御されます。以下では、市販のコンポーネントから単純なFRETシステムを組み立てるための手順を説明します。

1. 顕微鏡に光源を接続します。例えば、選択的にほとんどはバイオセンサーをFRETのドナーとして使用される強化シアン蛍光タンパク質（CFP）を励起単一波長の発光ダイオード（P、E-100、440 nmをCoolLED）を使用します。それが直接することができますLYと簡単に顕微鏡の落射照明用ポートに接続されている。同様の方法で接続することができる利用可能な多波長のLEDもあります。代わりにこのようなXBO75キセノンアークランプ（しばしばオリンパスとツァイスの顕微鏡に使用される）またはHBO水銀ランプ（通常はニコンの顕微鏡にインストールされている）として、LED、その他の標準的な光源を使用することができます。蛍光灯の場合には、また、あなたのサンプルに来る励起光のソフトウェアアシスト制御を可能にするためにランプや照明ポートとの間のシャッターを配置する必要があります。それが直接ソフトウェアによってオンとオフを切り替えることができるのでCoolLEDは、追加のシャッターを必要としません。様々なフィルタセットを持つ蛍光灯が複数と二分子バイオセンサーを操作する際は特に、もっと柔軟な選択肢である間、単一色LEDのシステムの欠点は、励起波長の数が限られています。あるいは、モノクロメータの光源（ 例えばポリクロームV、TILLPhotonics）ができる使用される、彼らは通常のトリガ信号を介してソフトウェアを制御することができる統合されたシャッターを持っています。
2. 顕微鏡に適切なフィルタキューブを置きます。 FRETペアとしてCFPと強化された黄色蛍光タンパク質（YFP）またはそれらの変異体のいずれかで測定をFRETルーチンのために、私たちはLEDが使用されている場合は省略することができますが、不可欠であるET436/30M励起フィルターを（含んでいる単純なフィルタキューブを使用キセノン​​または水銀ランプではなくLED）とDCLP455ダイクロイックミラーを使用しているとき。顕微鏡も計画 - フルオロ、プラン-neofluarまたはプラン·アポクロマート、40倍60倍または100倍の油浸対物レンズと、たとえば、良い分解能蛍光顕微鏡に適した目標に装備する必要があります。
3. 蛍光灯のスイッチを入れ、光スポットが均等に視野に分散されているかどうかを確認します。この条件が満たされない場合、LEDやランプの追加のアラインメントは、試料の最適な照明を達成するために必要とされています。これは、パフォーマンスすることができます空間内のダイオードやランプを配置し、ネジを使用してのmed。
4. 顕微鏡の排出ポートのいずれかにCマウントを介してビームスプリッタを接続します。たとえば、同時に単一のCCDカメラチップで監視することができる2つの（ドナーとアクセプター）のチャネルに放出光を分割DV2デュアルビュー（Photometrics）を使用します。あるいは、このようなOptosplit（ケアン研究）または浜松ORCA-D2二波長カメラに組み込まれ、ビームスプリッタなどの他の同等の製品があります。 CFP / YFP FRETペアのために、私たちはフィルタがDV2に付属して505dcxrダイクロイックミラープラスET480/30MそれぞれCFPとYFP用ET535/40Mエミッションフィルタを含む設定05-EMを使用しています。代わりに、ビームスプリッタ、ドナーのための2つのフィルターキューブ（CFP、DCLP455ダイクロイックミラーとCFP発光フィルター用ET436/30M励起フィルターを含む）とアクセプター（CFP励起フィルタ、DCLP455およびYFP発光フィルターを含む）のチャンネルはで使用されている多くはシステムをFRET。あるいは、カメラの前に任意の発光フィルタと自動発光フィルタホイール位置のない一つのフィルターキューブをインストールすることができます。この場合、電動顕微鏡またはレシオメトリックイメージングを実行するために〜200から300ミリ秒以内に2発光フィルターの位置の間のフィルターホイールを交互に行います。イメージングではなく、両チャネルの本当に同時取得は重要ではないのcAMPシグナル、細胞内のプロセスを遅くする場合は、このマイナー遅れは許容されます。
5. ビームスプリッタにCCDカメラを（例えば浜松ホトニクスからORCA-03GまたはORCA-R2の使用）を接続します。カメラに付属のマニュアルに記載されているように、IEEE1394コンピュータインタフェースにカメラを接続するためのFireWireケーブルを使用します。カメラに切り替えることなく、カメラのドライバをインストールします。
6. 最後に、コンピュータと光源との間の通信を確立するために、LEDやtにArduinoのI / Oボード（例ArduinoのDuemilanoveやArduinoの宇野のための使用）を接続し図2に示すように、ピンGND（0）して、ボードの8に接続されたLED側ともう一方の端にある2つのシングルワイヤーで通常のBNCプラグが含まれているはずですBNCケーブルを使用してシャッターをO。組み立てられたボードは、直接お使いのコンピュータのUSBポートに接続することができます。

2。イメージングソフトウェアをセットアップする

カメラによる撮像を有する光源を制御し、同期させるには、イメージングソフトウェアをコンピュータにインストールする必要があります。 MetaFluor（Molecular Devices社）、Slidebook（インテリジェント·イメージング·イノベーション）、VisiView（Visitronシステム）など、いくつかの市販のソフトウェアパッケージがあります。ここでは、低コストのイメージングのための高い柔軟性を提供していますオープンソースのマイクロマネージャフリーウェアの使用方法を示しています。

1. でこのソフトウェアをダウンロードhttp://valelab.ucsf.edu/〜MM / MMwiki /インデックス。PHP /マイクロManager_Version_Archive。我々は簡単に我々の手で設定可能である1.4.5のリリースをインストールすることをお勧めします。
2. お使いのコンピュータのUSBポートにArduinoのボードを接続します。からArduinoのボードを制御するソフトウェアダウンロードhttp://www.arduino.cc/en/Main/softwareを 。このウェブサイト上で見つけるの指示に従って、このソフトウェアをマイクロマネージャー起動する前に一度だけ実行してください。マイクロManagerソフトウェアでボードを使用するためのコードをアップロードしてください。コードでダウンロードすることができますhttp://valelab.ucsf.edu/〜MM / MMwiki / index.phpを/アルドゥイーノ 。
3. LEDやカメラのスイッチを入れます。ソフトウェアを起動し、[ツール]> [ハードウェアの構成ウィザード（ 図3を参照）を選択することにより、カメラとLED（他の光源とシャッター）によるマイクロマネージャー通信を構成します。お使いのカメラなどの必要なコンポーネントを追加（ すなわちHamamatsu_ DCAM）とArduinoのボード（Arduinoのスイッチ 、 アルドゥイーノ-ハブとArduinoのシャッターデバイスを追加します）。次のステップの間に、ウィザードによって提案されたデフォルト設定を使用します。ウィザードの指示に従って、新しいシステム構成を保存します。
4. [ツール]> [デバイスのプロパティブラウザを開くには、メインメニューを使用します。 "Arduinoのスイッチの状態"までスクロールダウンし、 "1"を選択します。ダイアログを閉じます。 "オートシャッター"ボックスがメインソフトウェアのダイアログでチェックされていることを確認してください。ファイルを押して>ソフトウェアを起動した後にいつでも開かれるべきソフトウェアのコンフィギュレーションを保存するにはシステム状態を保存します。これにより、ボードと画像取得を実行するために必要なソフトウェア間の通信を確立します。
5. カメラからの信号をモニターするために "ライブ"ボタンを押してください。蛍光灯が "ライブ"または "スナップ"機能が選択されている任意の時間に行くことを確認してください。最初の測定を開始する前に、あたりにビームスプリッタに付属の指示に​​従ってください両チャンネルの光学的アライメントを形成している。

3。細胞培養およびトランスフェクション

1. オートクレーブしたラウンド24ミリメートルのガラスcoverslides（ウェル当たり1 coverslide）で6ウェルプレートを準備します。あるいは、ガラス底細胞培養皿を使用することができます。
2. 細胞は1日後にコンフルエントに50から70パーセントに到達するようにD-MEM培地でプレート板や皿の上に293A細胞（10％FCS、1％L-グルタミンおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を補充）。
3. めっき後の24時間は、リン酸カルシウムトランスフェクション法（3.5参照）を用いてプラスミドFRETセンサーと層流ベンチで細胞をトランスフェクトする。 cAMPのバイオセンサーのプラスミドは、要求に応じて我々のグループから取得することができます。リーダーはまた、他のcAMPバイオセンサーを記述する包括的なレビュー^7,8と呼ばれています。
4. 初めて細胞をトランスフェクトする前に、トランスフェクション試薬を準備します。の2.5M CaCl ₂および2xBBSソリューションを構成している（後者は含む1.5mMののNa ₂ HPO _4、50mMのBES、280 mMのNaCl、NaOHでpHを6.95に調整）を脱イオン水インチ無菌ろ正規0.2μmのフィルターを使用してソリューションを提供しています。
5. の6ウェルプレートまたは6ガラス底皿をトランスフェクトするために、ミックス10μgのは、最大500μlに2.5M CaCl ₂溶液の滅菌水センサープラスミド50μlをFRET。よく混ぜる。
6. 2倍のBBSの500μlを添加する。よく混合し、室温で10分間混合物をインキュベートする。
7. トランスフェクション混合物をピペットで165μLを各ウェルまたは皿の上に滴下した。そっと板をかき混ぜるとインキュベーターに戻します。細胞は、通常、トランスフェクション後24時間測定するFRETの準備ができている。これは、いくつかの細胞表面受容体の活性に影響を及ぼす可能性があるので、細胞が、この時点でコンフルエントに達していないことを確認してください。

4。生細胞内で測定するFRET

1. 初めて測定する前に、144 mMのNaCl、5.4 mMのKClを、1を含むFRETバッファを用意mMのMgCl _2、2mMのCaCl _2、脱イオン水で10mMのHEPESおよびNaOHで7.3にpHを調整する。 FRETバッファを使用してイメージング実験で使用される化合物を希釈します。
2. イメージングソフトウェアを起動します。以前に定義されたシステムコンフィギュレーションをロードします。以前に構成されたシステム状態を選択し[ファイル]> [ロードシステム状態を選択します。
3. イメージング室（ 例えば Attofluorセルチャンバー）等に付着したトランスフェクトされた293A細胞とcoverslideをマウントします。バッファをFRETで一回細胞を洗浄し、バッファをFRETの400μlを添加する。ときに接着細胞を洗い、皿当たり緩衝液2mlを加えガラス底細胞培養皿を用いた。私たちには、CO ₂制御は必要ありませんので、HEPESを含むFRETバッファに室温ですべての測定を実行する。
4. 客観的にいくつかの液浸油を入れて、上に結像顕微鏡室を移す。透視光を用いた細胞層に焦点を当てています。
5. 蛍光LIG上のスイッチ"ライブ"ボタンを押して、HT、および実験用のセルを選択します。それはあまりにも明るく、暗すぎないではないがあるべきである、最適なセンサー式でセルを選択してください。適切な細胞を見つけた後、FRETセンサーの光退色を避けるために直ちに蛍光灯のスイッチを切ります。
6. "スナップ"ボタンを押した後に取得された画像の良好な信号対雑音比を導く方法で "カメラ設定"（通常は10から50ミリ秒）の下で露光時間を調整します。低画質では短すぎる倍の結果ながら、あまりにも長い励起時間は、退色が発生する場合があります。
7. "マルチ - D ACQ"を押してくださいボタンとタイム·ポイント数と画像取得の時間間隔を設定します。当社のcAMP-FRETセンサーのために、私たちは5秒ごとに一枚の画像を取得する。
8. "Acquire"ボタンを押して測定を開始します。
9. 任意の測定中に、1つは"オンラインFRET"プラグイン（ オンラインサプリメントで利用可能な、すべてのプラグインが警官である必要があります使用することができますオンラインFRET比の変更を監視する）、それを起動する前に、あなたのマイクロManagerソフトウェアの "plugins"フォルダにiedを。このプラグインを実行し、 "フリーハンドの選択"ツールを使用してFRET比画像の関心領域を選択します。 ROIのマネージャに領域を追加し、 "タイム·シリーズ·アナライザ"ウィンドウ内の "Get平均"ボタンを押してください。比のトレースが表示されますFRET。測定中にトレースを更新するには、 "FRETratioOnline2"プラグインを実行し、 "GetAverage"ボタンを押してください。
10. できるだけ早くFRETとして比率が安定したベースラインが正確に皿/チャンバーにそれをピペッティングすることにより、所望の化合物を適用するに達している。薬理学的化合物で細胞を治療するには、代わりに単純なピペッティングの灌流システムは、この段階で使用することができます。
11. 実験を終えた後、画像のタイムラプススタックを保存します。顕微鏡から測定チャンバーを取り外して、客観的な組織を用いて客観的に清掃してください。
12. で測定を繰り返す4.3のステップに戻ります新しいサンプル。

5。オフラインデータ解析

FRETイメージングデータはImageJのソフトウェアを使用して実験した後、いつでもオフラインで分析することができます。このプロトコルを補完するものとして、私たちは "FREToffline"プラグインは、ドナーとアクセプターのチャンネルに取得した画像を分割するために、対象となる複数の地域で蛍光強度を測定するために、我々の研究室で使用されています。これらの強度はさらに比率をFRET訂正を計算するExcelや起源スプレッドシートにコピーペーストすることができます。単分子FRETバイオセンサーの変化を可視化するために、単純なratiometryが用いられることが多い。この場合、唯一のドナーフルオロフォア（CFP）が励起され、二つの画像はCFPとYFP発光ピークで撮影されます。計算されたYFP / CFP比（時には、CFP / FRET比と呼ぶ）は、2つの蛍光色素分子間のFRETの程度を表しています。単分子バイオセンサーでは、CFPとYFPの部分の数字は単純なratiometryが十分であるように、等しいFRET効率は^12を表す^のにcient。

1. [プラグイン]> [マイクロマネージャ]> [開く]マイクロマネージャーファイルを選択することにより、実験ファイルを開くにはImageJのソフトウェアを使用してください。
2. 個々のCFPとYFPのチャンネルにタイムラプススタックを分割する "FREToffline"プラグインを実行します。
3. バックグラウンド補正が必要な場合、これはImageJのソフトウェアを使用して行うことができる。
4. 画像のYFPをスタック上にクリックして、1つ以上の "フリーハンドの選択"ツールを使用して関心のあるいくつかの領域を選択し、 "追加"ボタンを押すことで、ウィンドウ内のプラグイン "MultiMeasure"に追加します。
5. "MultiMeasure"ウィンドウの関心の領域を選択して、各フレームと各領域の平均グレイ値を持つテーブルを取得するために "マルチ"を押してください。 Ctrlキーを使用して、すべてを選択することにより、クリップボードにデータをコピー+とCtrl + Cキーを押すことにより、 Excelや起源スプレッドシートを開き、Ctrl + Vキーを押して、データを貼り付ける
   プログラムによって実行される測定が>セットMを分析の下に設定することができますあなたが測定されるパラメータを定義することができますeasurements。我々は通常のみ、このダイアログボックスで、 "グレー値の平均値"を選択します。
6. 画像のCFPのスタックにクリックします。 5.5で説明したように同じことを実行します。同じExcelやOriginのスプレッドシートにCFPの強度データを貼り付けます。
7. ExcelやOriginソフトウェアを使用して、修正されたFRET比を計算する。シンプルな単鎖単分子バイオセンサーを撮像する場合、我々は唯一のアクセプター·チャネルへのドナー蛍光のbleedthroughを修正。この場合、訂正アクセプタ/ドナー比は次のとおりです。
   比=（YFP - B X CFP）/ CFP
   ここで、Bは、CFPとYFPプラスミドチャネル（B = YFP / CFP）のドナー蛍光の割合を測定すると細胞をトランスフェクトすることによって決定することができる補正係数である。それが唯一の曲線の形状上の任意の質的な影響を与えることなく、FRET応答の全体的な振幅に影響を与えるので、単分子バイオセンサーは、この補正を省略すると、可能性があります。

図1は、完全組み立ての例はCoolLEDニコン倒立顕微鏡、DV2デュアルビュー、浜松ORCA-03G CCDカメラで構成される画像の設定をFRET。示しハードウェアコンポーネントとコンピュータ間の通信を確立するには、I / OのArduinoボードがコンピュータに接続され、 図2に示すようにCoolLEDする。同期化された方法で、カメラでキャプチャし、光源と画像を制御するには、マイクロManagerソフトウェアをインストールする必要があり、適切に構成します （ 図3を参照）。このフリーウェアは簡単にプラグインが必要なを追加して、個々の実験的なニーズに適合させることができます。 図4Aは、代表的な生は、β-アドレナリン作動薬の効果をモニターする293A細胞で発現Epac1-キャンプ¹³のcAMPセンサーを用いて測定値から比トレースをFRET示しイソプロテレノールは、時刻150秒で適用され、＆賭ける;プロプラノロールブロッカーは、時刻300秒（4.3から4.10で説明されるように行われた）で追加された。訂正を得るために5.1から5.7で説明したように、これらのデータは、オフラインとYFPチャンネルにCFPのbleedthroughを補正し分析することができ、図4Bに示す割合トレースをFRET。この代表的な実験では、細胞内cAMPの増加を示し、イソプロテレノール処置によりFRET監視比で遅い減少を示す。 β遮断薬とプロプラノロールは基底レベルにcAMPの減少につながる、イソプロテレノール信号を反転させます。 FRETシグナルにおけるこれらの変化は、どの実験（のように4.9で説明します）の間にオンラインで監視することができます。このような実験は異なるセカンドメッセンジャーまたは生化学的プロセスを監視するために設計され、一般的に使用されるバイオセンサーの様に行うことができる。

図1に、CoolLED成るFRETイメージングセットアップのレイアウトvertedニコン顕微鏡、DV2デュアルビュー、およびORCA-03G CCDカメラ。

図2のArduino I / Oボードとその接続。ボードは自己マウントプラスチックの箱に配置されている。標準のBNCケーブルは8ピンと基板のGND（0）にLEDを接続します。

ハードウェアの構成ウィザードを使用して、システム·コンポーネントの統合を示す図3スクリーン）ハードウェア·コンフィギュレーション·ウィザードを起動します。2.3で述べたようにB）が必要なデバイスを追加します。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4代表がexperimenのFRETEpac1-293Aキャンプでトランスフェクトした細胞内のcAMPレベルを測定トン。まず、細胞（YFP / CFPのFRET比の低下として観察）cAMPを増加させるβ-アドレナリン作動薬のイソプロテレノール（100 nMで、フレーム30または150で秒で）で刺激した。細胞はその後のcAMPの減少を反映し、FRET比の増加につながるプロプラノロールのβ-ブロッカー（秒フレーム60℃または300℃、10μM）で処理した。）原材料オンラインでは、対応する関心の1つの領域から比トレースをFRETオフラインデータ解析として5.1から5.7で説明を行った後、実験中に監視単一のセルに。B）の比率トレースを修正しました。

特別な利害関係は宣言されません。