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概要

マウスの発達研究は妊娠中に胚の到達不能によって妨げられている。妊娠の後期段階で胚の心臓の長期培養を促進するために、我々は摘出心臓が半固体、希釈マトリゲルで培養されているプロトコルを開発しました。

Abstract

マウスの発達研究は妊娠中に胚の到達不能によって妨げられている。したがって、プロトコルを分離し、関心のある個々の器官培養物は、両方の発展の変化を可視化することができると新規な治療戦略の方法を提供することが不可欠である。妊娠の後期段階で胚の心臓の長期培養を促進するために、我々は摘出心臓が半固体、希釈マトリゲルで培養されているプロトコルを開発しました。この基板は、三次元構造を維持するのに十分なサポートを提供するが、継続的な縮小を可能にするのに十分に柔軟である。簡単に言うと、心臓を胚から切除され、増殖培地で1:1に希釈したマトリゲル冷の混合物中に置いた。希釈したマトリゲルが固化した後、増殖培地を培養皿に添加される。胎生16.5限り遅く摘出ハーツは4日後に解剖のために生存していた。冠状動脈神経叢の分析は、このメソッドがないことを示してい冠状血管の開発を妨害。したがって、私たちは、胚の心の長期培養のための新たな方法を提示する。

Introduction

近年、トランスジェニックマウスは、開発心臓欠陥を研究するための支配的なモデルシステムとなっています。しかしながら、このようなゼブラフィッシュなどの他のモデル生物では、マウスに比べて大きな利点を有することが証明されている。心臓の開発を容易に可視化することができます胚の光透過性、、、ゼブラフィッシュの3つの主要な利点は、胚へのアクセスを容易にするために、卵の外部敷設され、に小分子治療法を適用することの容易さは、胚の発達を調節する^1。したがって、胚器官の元の子宮内成長を許容培養技術の開発は、少なくとも部分的に制限が現在のトランスジェニックマウスの発達プロセスを研究者が経験する、バイパスだろう。

ex vivoで心臓の培養系がどのように差の小分子と分析による治療を可能ニワトリ、マウス胚の両方で開発されている心臓のferent領域は^2-6を伝える。全体のマウス心臓の文化のために、心が胚に胚から取り上げ（E）年齢12.5ロッキング^2,3,5の有無にかかわらず培地に配置することができます。この技術を用いて、胚の心臓が正常E13.5の均等にインキュベートされており、ロッキングと共に培養し心臓は限り三日（E10.5から始まる^）3として維持されている。しかし、研究では、年上の胚から心臓の正常な文化を報告しなかった。同様に、レスキュー実験培地²にグローバルに治療剤を塗布に限定されている。

心が、摘出埋め込まれており、ビブラトームを使用して区分されているスライス培養システムは、また、E12.5マウスの心とハンバーガー·ハミルトンステージ36（約E16マウスで）ひよこの心のように両方の若い心、のために利用されている^2,4,6、およびそのような産後および成体マウスhと年上の心、eartsと成人の心^7,8。胚の分析が一般的に150μmの厚さのセクション^2,4を活用^しているが、セクションの厚さは酸素欠乏⁸の証拠なしで偉大な500μmとすることができます。これらのスライス培養物は、ほとんどのスライスが、この期間⁹を通じて収縮性を維持することで、文化の中で二ヶ月限り、維持されている。隔離された心筋細胞の研究に比べて、これらのスライス培養は、その隣接セル型と心筋細胞の共培養を可能にし、ex vivoでの解析のための有用な方法を提供します。しかし、これらの文化は単に培地中の心を（ 例えばビブラトームで切片のライブの心臓を埋め込 ​​む）を置くよりも精巧なセットアップが必要であり、任意の分析が明らかにセクション内で心臓の一部に限定されています。

制限は培養マウス胎児心とトランスジェニックマウスAVAの富のために、上記を考える研究のためilable、我々はウィーバーらによって開発されたex vivoでの肺培養系に似たex vivoでのマウス心臓培養システムを開発しました¹⁰私たちの培養系全体マウス胎児心内改造冠循環の長期培養と可視化を可能にします。また、マトリゲルの使用は、従って、治療剤と局所治療を提供し、ビーズを心臓周辺の所定の位置に保持することができる。これらの実験は、冠動脈形成などの工程上の所与の治療効果を比較するために異なる発生時点で行うことができる。小分子はマトリゲルを通って拡散することができるので、この培養系はまた、特異的な細胞 – 細胞接触が特定の発達プロセスのために、または1つの領域から他方の傍分泌シグナル伝達があるかどうかが必要であるかどうかを決定するために互いに近くに心臓の培養解剖した領域に使用することができる必要。

この培養系比較的単純であり、スライス培養系とは異なり、基本的な培養試薬は、ほとんど研究室で容易に入手可能であるセットアップを使用する。要するに、胚心臓を摘出した半固体支持体を提供する希釈マトリゲルで培養される。このサポートは、契約に心を可能にしながら、心臓の三次元形態を維持するのに十分である。このシステムを使用して、古いマウス胚（E14.5-E16.5）から、全体の心は、最大4日間の培養で維持することができます。全体冠状動脈神経叢が維持され、スライス培養とは異なり、心臓のさまざまな地域から発生したすべてのシグナリングキューが存在したままそう。また、生細胞の蛍光色素は、ライブ心臓の可視化を可能にするマトリゲルに浸透することができ、タンパク質 – 結合ビーズ、ローカライズされたシグナリング·ソースを提供するために、心臓の近くに配置することができる。一緒に、これらの利点は、この手法をembryonの発達過程を研究するための理想的な方法を作るICのマウス心臓。

Protocol

1。胚ハーツを切除承認された安楽死法を用いて、所望の胎生で時限妊娠マウスを安楽死させる。全ての実験は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校で制度動物実験委員会によって承認された。 自由に解剖する前に70％エタノールで女性をスプレー。子宮角を取得し、消費税に女性の腹腔を開きます。 コー​​ルド1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）表示し、必要に応じてすすぎを含むペトリ皿に子宮角に置きます。添付された胚嚢を露出する正中線を経由して子宮角を切り開く。 胚嚢を開いてカットし、胚を取り出す。冷PBSで二ペトリ皿に胚を置きます。氷に子宮角とペトリ皿を返します。 胸壁へのアクセスを改善するために胚の首。ジェノタイピングが必要な場合は、削除し、氷上に置いたエッペンドルフチュー​​ブ内の尾を保存する。 ととも​​にその背中に胚、心臓や肺を可視化するために胸壁を開いてカット。段階に応じて、胸壁は、透明であってもよい。 慎重にピンセットを用いて心臓を持ち上げ、下に血管を切った。その後、心を解放するために大血管の上にカット。必要であれば、余分な組織を除去する。 冷PBSで満たされた24ウェルディッシュの1つのウェルに心を置き、氷の上にお皿を置きます。 心はすべての胚から摘出されるまで、上記の手順を繰り返します。 2。文化セットアップ層流フードでは、1:1の割合で風邪マトリゲル希望培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で例えば 、10％ウシ胎児血清（FBS））配合しています。プレ暖かい培地ない。 氷も、氷の上で維持されている24ウェル培養皿のウェルに希釈液のピペット500〜1,000μlの上希薄マトリゲルを保つ。 フードでは、慎重にピックアップし、切除を配置マトリゲル含有培養皿のウェルにおける心臓氷の上で培養皿を保ちながら。 埋め込まれた心臓の向きが重要である場合：たっぷり70％エタノールで倒立顕微鏡と周囲の空間をスプレー。フードでは、まだ氷の上ながら、マトリゲル含有培養プレートのウェル中に摘出心臓を配置。その後、顕微鏡でプレートを配置し、素早く向きを摘出心臓をマトリゲルが固化し始めると。 加湿37℃インキュベーター（5％CO 2）で培養皿を置き、マトリゲルは、約30分間固化することができます。 よく心臓を含む各1ミリリットル予め温めておいた培地を追加します。 ハーツは、少なくとも4日間培養中に残ることができます。 2日ごとに培地を変更することをお勧めします。 3。固定と可視化必要であれば、生きて心を可視化する蛍光生細胞色素（ 例えば SYTO-16）を追加します。写真は次のようになりますそれが埋め込まれた位置に基づいて表示される心臓の側に限定。 培養後の解析（ 例えば全体のマウントイメージングまたはセクショニング）が行われる場合には、培養培地を除去し、冷4％ホルムアルデヒドで置き換える。 30分間氷上で皿を置きます。 冷たいホルムアルデヒドや氷がマトリゲルの溶解を促進した後、新鮮なホルムアルデヒド（およびマトリゲル）固定液を交換して、一晩4℃の心を修正 4°Cまで、さらなる分析にバッファ（ 例えば PBSまたはトリス）とストアと心を洗う。

Representative Results

この技術を用いて、心臓の三次元形態を維持し、継続的な収縮（ 映画1）で示されるように、実行可能なままである。これらの収縮は心室に比べ心房で一貫してより顕著である。文化に続いて、ハートは固定されており、処理された特定のマーカー発現や構造を調べるために免疫組織または組織学のどちらかのために、図1（a）は固定され、24時間培養したマウス胎児…

Discussion

現在の培養系は、胚マウス心臓研究のための重要な利点をもたらす。この培養系でも文化の中で4日後、壊死の限られた兆しで、心筋収縮と冠動脈叢を維持します。さらに、半固体マトリックスは、培養中の場所にコーティングされたビーズを保持するためにも契約に柔軟性を可能にしながら、発展途上心臓の三次元形態を維持するのに十分なサポートを提供。このサポートにもかかわらず、…

Materials

			REAGENTS
Timed-pregnant mice			To be dissected at the embryonic stage of interest
PBS (1x)
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Growth factor-reduced Matrigel	BD Bioscience	356231
Syto-16	Invitrogen	S7578	Used as directed in 13
24-well culture plate	Fisher Scientific	07-200-84
			EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110