マウス胎児腸全体培養システム生体外シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

各腸絨毛は、上皮表面層と間葉系コアの2つの主要な組織区画で構成されています。マウスの小腸は、内胚葉のシートが閉じて密封され、間葉系細胞³に囲まれた上皮の管を形成する胚の10日目に形成されます。この扁平な上皮管は急速な増殖を遂げ、長さと胴回りの両方で成長し、動的な細胞形状の変化を伴う劇的な再配列を経ます¹。同時に、周囲の間葉も、血管神経叢の形成、平滑筋の分化、腸管ニューロンの動員など、多くの発生過程を経ます⁴。胚の14.5日目の近位小腸では、ヘッジホッグおよびPDGF応答性細胞の凝縮(クラスター)が上皮に隣接して形成され始めます^2,5。間葉系クラスターの形成は、腸の長さに沿って広がり続け、胚の16.5²までに小腸全体を覆います。間葉系クラスターが形成されると、クラスターに最も近い上皮細胞は細胞周期から後退し始めますが、他の上皮細胞は増殖し続けます。細胞周期から撤退した間葉系クラスターの真上にある細胞は、出現する絨毛が内腔に屈曲するにつれて形状を変え始めます。絨毛のさらなる成長は、部分的には、出現する絨毛間の上皮の継続的な増殖によって推進されます。間葉系クラスターは、成長中の絨毛の上皮にしっかりと付着したままで、さまざまなシグナル伝達分子を発現し続けます。絨毛の出現の波は、間葉系クラスターの形成に続いて小腸の長さに沿って伝播します。腸が成長を続け、絨毛間領域が出現する絨毛の間に広がると、新しい間葉系クラスターが絨毛上皮に隣接して形成され、さらに絨毛の出現と成長が続きます⁶。

上皮と間葉の同期発達は、絨毛の形態形成に不可欠です。シグナル伝達分子は、一方の層から他方の層に分泌され、受容体はシグナルメッセージを受信して伝達し、上皮と間葉の間の発達を調整します。間葉系クラスターはシグナル伝達センターとして働き、さまざまな発生モルフォゲンを発現します^7-10。クラスターの形成またはパターンの混乱は、絨毛の出現とパターンの喪失をもたらします。PDGFシグナル伝達の阻害は、より少ないクラスターとより少ない絨毛をもたらし、形成されたそれらの絨毛は、異常な^{クラスター11}に続いて変形する。ヘッジホッグシグナル伝達の喪失は、クラスター形成の完全な喪失と絨毛の出現の失敗をもたらします^2,12。まとめると、これらのデータは、クラスターが絨毛上皮とその間葉系コアの発達を調整していることを示しています。

この全臓器培養システムを使用して、上皮間葉系クラスターのクロストークに関与するシグナル伝達を変更し、それらのシグナルが絨毛の形態形成における役割を決定することができます。2光子共焦点光学セクショニングと再構成により、クラスター形成と絨毛の出現を3次元で視覚化し、間葉系クラスターとその上にある上皮との間の空間的関係をよりよく理解することができます。培養システムを4次元に拡張することで、発育中のクラスターと絨毛のzスタックを経時的に捕捉し、これらの相互作用を観察することができます。最終的に、この方法で絨毛の発達を追跡し、シグナル伝達の変化に伴って発生する変化を観察する能力は、絨毛の形態形成における上皮間葉系相互作用の理解に革命をもたらすでしょう。

注：すべてのマウスを人道的に実験動物医学ミシガン大学医学部号機大学によって承認されたプロトコルを使用し、動物の使用およびケアに関する研究委員会のガイドラインに従って取り扱った。

1全臓器培養システム

1. 培地および培養プレートの調製
   1. 組織培養フードでは、ストックボトルからBGJbメディアの5ミリリットルを除去し、ペニシリン/ストレプトマイシンを5ml加える。 （ペニシリン/ストレプトマイシンで）BGJb培地49 mlに5 mg / mlのアスコルビン酸の1ミリリットルを加えることで、50ミリリットルコニカルチューブ内のメディアの作業ストックを準備します。
   2. トランスウェルのそれぞれの下に1ミリリットルを追加することによって、6ウェル培養プレートを準備します。
      注記：すべての6トランスウェルを使用しない場合は、後で使用するために、新鮮な無菌6ウェルプレートに余分なトランスウェル移動します。 3 10センチメートル無菌ペトリ皿のそれぞれに作業BGJbメディアの3ミリリットルを追加します。
2. 解剖の準備
   1. 70％のETHAに解剖ツールを浸すとNOL作業中にきれいな道具を保管してください。
   2. 大きな氷​​のバケツに解剖エリアを設定し、氷上でBGJbメディアを6ウェル培養プレートから10cmペトリ皿を置きます。解剖と文化のための腸の準備中に、できるだけ多くの氷の上で作業。
   3. 胎児の腸の収穫のために頸椎脱臼により安楽死の前にイソフルラン（100μL）をチャンバー内での成体雌マウスを麻酔。
   4. 母親から胎児を収穫した後、タイラーステージングチャート¹³に従って慎重にそれぞれの胎児を上演。日常的に、単一のゴミ内で観察された発生段階で最大24時間の変動などの各胎児の年齢を決定するために、後の性交日に依存しないでください。
3. 胎児の腸の解剖
   1. 前腸の除去に断頭によって胎児を安楽死させる。
   2. 1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で各腸を分析した後、ナンプラーBGJbメディアを作業した10センチメートルペトリ皿にそれをCE。
   3. 慎重に胃および上部十二指腸から胃や膵臓から脾臓を除去します。
   4. 静かに腸がまっすぐにさせることが可能とだけ十分な接続を分離する限り添付大網を残すように注意しながら大網を分離。
      注：E14.5より古い腸以上24時間未満培養されたもののために、静かに管腔内容が腸を通って流れるようにし、切断端から排出されるために可能にするために3等分腸を分離する。培養はE13.5前に始まっただし、漿膜が正常に腸の長さにわたって成長を可能にするために、腸の3つのセグメントを分離する前に、培養24時間後まで待ちます。
   5. 培養プレート（1.1.2）のトランスウェル上に腸の部分を転送するために口のピペットを使用してください。
   6. 彼らはtranswel渡って真っ直ぐになるように、必要に応じて静かに腸の位置を変更lである。
      注：腸管を通って管腔内容物を移動させ始めると、腸がねじれは、腸へのバックアップや損傷の原因となります。
4. 文化と治療
   1. トランスウェルの下に（追加された組換えタンパク質または薬理学的阻害剤と作動媒体）、トランスウェルの下から培地を除去処理培地700μlのを追加します。
   2. 腸の上に処理媒体の滴ずつ300μlのを追加し、それがトランスウェルを通して浸すことができます。必要に応じて腸の位置を変更。
   3. 処理媒体は、少なくとも一日一回またはより頻繁に治療試薬の半減期に応じて変化する。
5. 治療試薬の局在化のためのタンパク質源浸したアガロースビーズの調製
   1. 彼らの貯蔵容器にアガロースビーズを再懸濁し、1.5mlマイクロチューブにアガロースビーズを100μlを移す。
   2. 無菌1×pHのチューブの残りの容量を埋めるosphate-緩衝生理食塩水（PBS）と、それらを洗浄するためにビーズを混ぜて。ビーズが底に沈殿した後、ビーズの上から、PBSをオフにピペッティングすることを可能にするために数分間ラックにマイクロチューブを置きます。無菌1×PBSでマイクロチューブを補充し、さらに2回の洗浄工程を繰り返します。
   3. 2回の治療のために所望の濃度で目的のタンパク質を準備します。
   4. 2倍のタンパク質原液5μlの水で洗浄したアガロースビーズを5μlを混合し、静かに、タンパク質中のビーズを攪拌する。静かに10〜15分毎に混合、1時間チューブを氷上に置きます。
   5. 腸にビーズを配置する前に、滅菌1×PBS中で簡単にビーズをすすぐ。
6. アガロースビーズの配置
   1. 静かに引っ張らキャピラリー針で口のピペットを用いて腸の上にアガロースビーズを配置します。乱暴な取り扱いが腸を損傷し、損傷した領域に絨毛の発達を防ぐことができますように細心の注意を払ってビーズを配置します。
   2. 腸蠕動運動や培養時間にわたる腸のオフにロールバックされます置かれたビーズの約半分を受けるので、分析に必要とされる2倍のビーズを配置します。
7. 培養された腸の固定
   1. 慎重にトランスウェルの下から処理媒体を除去し、3分間空気乾燥腸を可能にします。
   2. その後定着時間の残りのための固定液2mlで腸の上部をカバーする、2分間のトランスウェルの下の固定液1ミリリットルを追加します。 4℃でまたは室温で2時間、4％パラホルムアルデヒドのO / Nで固定してください。

固定腸の2イメージング

1. ホールマウントイメージング
   1. 1X DPBS100μlのスライド上で（内因性蛍光を含む）全体の腸を置きます。優しく腸を配置する鉗子を使用してください。
   2. 組織MOを作るために慎重に70％グリセロール100μlのDPBSを削除し、すぐに追加するには、実験室の組織を使用して、透明な再およびイメージングの可能性の深さを増加させる。
      注：腸のさらなる浸透が望まれる場合、代わりに70％グリセロール中に腸を取り付ける、10〜30分間、フォーカスクリア溶液の数滴で腸を浸す。ピペットでフォーカスクリアソリューションオフとマウント解除と腸をマウントします。
   3. 粘土にカバースリップの四隅を浸し、腸を平坦からカバースリップを保つために、スライドとカバーガラスの間にスペーサーとして使用するために、粘土の少量を拾う。
   4. 綿棒で塗布溶融しVALAPでスライド上にカバーガラスを密封。
   5. イメージ直立または倒立型共焦点顕微鏡のいずれかで、腸。詳細については、議論を参照してください。
2. （腸の構造の断面図のために）固定された腸のビブラトーム切片
   1. 小さなプラスチック金型7％アガロース（10×10×15ミリメートル）に埋め込む腸とにアガロースブ​​ロックを許可する冷却して凝固。
   2. 瞬間接着剤でビブラコレクションステージにプラスチック金型及びグルーアガロースブ​​ロックからアガロースブ​​ロックを削除します。
   3. 氷冷1X DPBSで収集段階を埋める。
   4. 100〜150ミクロンの間の厚さでセクションをカット。厚い部分は、断面が深く可視化すること（セクション2.1.2で説明します）決済ソリューションを使用してください。
   5. 4℃での保存のために6ウェルプレートのウェル内に収集段階からビブラトーム切片を注ぐ。
3. 固定、ビブラトーム切片の組織の免疫蛍光染色
   1. 1X DPBSで24ウェルプレートにウェル当たり5-12ビブラトームのセクションを配置します。
   2. 1X DPBSを削除し、ウェルあたり透過処理溶液500μlを加える。静かに、室温で25分間サンプルを揺する。
   3. 透過処理した後、1×PBSでサンプルを3回洗浄する。
   4. ブロッキング溶液500μlに、少なくとも30分間のサンプルをブロックします。
   5. ブロックした後、電子メールブロッキング溶液で希釈した一次抗体を500μlとブロッキング溶液をXchangeは、4℃のCO / Nでサンプルを保つ。
      注：凍結し、パラフィン切片上でうまく動作し、一次抗体希釈液は、通常、しかし、一般的に、このプロトコル（ 例えば、BrdU）のではうまく機能しない核抗原回復を必要とする抗体、あまりにビブラトーム切片上でうまく動作します。
   6. 翌日、ブロッキング溶液で15分間、試料を毎回3回洗浄する。
   7. 洗浄後、ブロッキング溶液中に希釈した二次抗体を500μlを適用します。光から蛍光団を保護し、室温で2時間に45分のためのサンプルを揺するようにアルミホイルで24ウェルプレートを包みます。
   8. 15分ごとに1×PBSでサンプルを3回洗浄し、2.4節で説明したようにスライド上のビブラトーム切片をマウントします。
4. 取付ビブラトーム切片
   1. ビブラトームダブルSTIの薄切りを切断して取り付けるためのスライドを準備するCKテープとスライドの長辺に沿ってそれらを配置する。
   2. 慎重に1×100μlのPBSの低下をスライド上に両面テープの間に5-10ビブラトームセクションを配置。
   3. すべてのセクションを展開するとスライド全体で単一層にそれらを広げた。
   4. フラットに座ってからカバースリップを妨げる余分なアガロースまたは不均一なビットを削除します。
   5. 慎重にビブラトーム切片の周囲から過剰1X PBSを吸収するために実験室組織を使用しています。
   6. ビブラトーム切片の上部に水性封入剤のドロップを追加し、その後カバースリップ。
   7. 綿棒で塗布溶融しVALAPでスライド上にカバーグラスを密封。
   8. イメージ直立または倒立型共焦点顕微鏡のいずれかでビブラトーム切片。イメージングシステムの選択についての詳細は、説明を参照してください。

全腸の3。ライブイメージング

腸fetuseから収穫E12.5後のsは、そのままに接続された大網で、成功した上記のシステムを用いて、培養中の絨毛を開発しています。したがって、このエキソビボシステムは、経時的な形態形成の三次元ビューを再構成することができる現像腸の生のz断面画像の捕捉を可能にする。

1. ライブイメージングの設定
   1. 細かいメッシュのスクリーンに個別のポリカーボネート膜を接着する瞬間接着剤を使用してください。これは直立共焦点顕微鏡の浸漬レンズ下の場所に腸を保持するための支持足場を提供します。ライブイメージング顕微鏡の選択についての詳細については、議論のセクションを参照してください。
   2. 中央ウェルの培養プレートにメッシュスクリーンを配置します。
   3. ポリカーボネート膜上に解剖し、腸を置き、両端に瞬間接着剤を一滴加える。腸に固定するだけの十分な接着剤を使用してくださいではなく、コート、それ！
   4. ポリカーボネート以下のフェノールレッドを含まない培養培地を追加します。培養プレートの中央ウェル中の膜。
   5. 湿度を提供するために、培養プレートの外縁に水を加える。
   6. イメージングしながら、腸の動きを制御するために、メディアの3ミリリットルの1×PBS中のキシラジンの5溶液：胎児の腸は、培養中の収縮の蠕動様の波を起こしているので、1を100μlを追加。この投与量は、絨毛の発達を損なうことなく、約8〜10時間、腸の動きを制御します。
   7. 腸の横断ビューの場合は3〜4％アガロース溶液中でのライブ腸を埋め込み、ビブラトーム上の厚い部分（150〜500μm）をカット。切断された腸の剛性とアガロースの剛性を合わせて、経験的に発達段階を決定した。一般的に、3％アガロース溶液はE14.5よりも若い腸に適していますし、4％溶液腸E15-E16に適しています。
   8. （3.1.1項のように）メッシュスクリーンに貼付されたポリカーボネート膜にビブラトーム切片を接着し、セクション3.1.2-3.1.6で説明したように文化。
   9. 調整可能なテーブル付きのアップライトスタンドに二光子共焦点蛍光顕微鏡（690-1,040 nmの励起レーザー）を使用したライブイメージングを実施する。
   10. GFPシグナルのための最高の解像度と深い浸透を提供するから900nmに同調二光子レーザー。イメージングながら、組織への損傷を低減します。また、可能な限り低い発光レーザのパワーを設定する組織損傷を減少させる。典型的には、二光子レーザーに12％の電力を使用して、GFPの良好な励起を得る。

このシステムは、薬理学的試薬または組換えタンパク質とシグナル伝達の操作を可能として、胎児腸の全体の外植片の培養は、腸の開発を調整シグナル伝達分子の位置、分布、および期間の分析が可能になります。トランスウェル培養系（ 図1Aは 、ウォルトンらから再生される。2012）2が組織上に薬物またはタンパク質浸したアガロースビーズを配置することを可能にし、それによってローカルシグナリング源を確立する気液界面（ 図1Bを提供）。 E18.5にE10の胚から採取された腸をトランスウェル上で培養中で生き残るためには、運動の蠕動様波を受ける。腸は、約10日間、またはおよそ陰窩形成が最初に観察され、P3、マウス発生段階に生き残るE13.5から文化に始まった。初期段階の腸が培養で生存しているが、腸が前に収穫漿膜は完全にその時までに、腸をカバーするために成長していないため、E12.5は、確実に可能性絨毛をemergeしないでください。間葉系クラスターは形成し、絨毛は腸内に出現し、長くし始める開発は少しウォルトンらから再生された未培養、ステージをマッチさせた対照（ 図1に比べて遅れているものの、E12.5、E13.5またはE14.5で培養物にスタートら 、2012）2。にかかわらず、培養開始（E12.5-E14.5）で、腸のステージの、腸は常に24時間のおおよその遅延が表示されます。 2日間培養で増殖させたE14の腸は子宮内で成長したE16の腸の絨毛よりE15の腸のものと類似している絨毛の成長（ 図1C-F）2 を示している。

間葉クラスターの規則的なパターンは、E15.5（ 図2で全体PDGFRαGFP / +腸管の光学切片の三次元再構成することによって明らかにされる</ strong>は、ウォルトンらから再生。、2012）2。この画像は、ライカLAS-AFソフトウェアによって縫合された視野の54分野のzスタックで構成されています。腸内の各スポットは、PDGFRα遺伝子座14から発現される核タグ付きGFPにより可視化した間葉系クラスタです。画像の高解像度は、視聴者がズーム·インするために特定の領域に詳細を調べることができ、まだ深くビューまたは低電力倍率の単一のフィールドから収集することができない空間的な関係を提供しています。 ムービー1は、ステッチのzをステップ実行するシリーズです3Dである-stackイメージは、図2に再建。個別の光学切片は、クラスター内の単一の細胞のような細部のさらなる可視化を可能にします。

PECAM抗体（BDファーミン557355; 1に希釈：1,000）を持つ腸血管系のホールマウント免疫蛍光の光学切片を、二光子励起と偵察を使用してキャプチャされたImarisソフトウェアとのstructed（ 図3）。腸の血管のこの三次元図は、完全に薄片の準備には理解できない血管系の複雑なネットワークを明らかにしている。 動画2、図3の再構成画像の回転3次元投影は、どのようにのさらなる理解が可能になる構造的パターニングの理解を向上させることができ設けられた3次元再構成することによって情報を増加させた。

ビブラトーム切片は、横断バンテージから腸の立体視が可能になります。 図4において、膜トマト（Rosa26遺伝子MT / mg）を15でマークされた開発クラスター上皮と間充織と周囲の14（PDGFRαGFP / +印）（の関係が観察される。

代替的に、この関係は、抗体によって見ることができるimmunofluore（抗PDGFRα（SantaCruz社のC-20で標識された緑、; 1に希釈：200））間葉クラスターのscence染色（ 図5）上皮と（赤、抗Ecadherin（BDトランスダクションラボ610181で標識; 1：1,000希釈）。

この全体の器官培養系はまた、胎児の腸を発症する二光子イメージングを可能にするように拡張することができる。このセットアップでは、胎児の腸は、より大きな培養プレートにメッシュスクリーンによってサポートされるポリカーボネート膜（ 図6）に接着されている。共焦点顕微鏡レンズを内部に十分に腸に接触するように培養プレートのウェルより大きなサイズが可能になる。

図1。トランスウェル培養系全体の胎児腸の開発。 （A）トランスウェルMEM上に置かれた胎児の腸BGJbメディアとの6ウェル培養プレート中ブレーン。上の2つの腸は、下の二つの腸E13.0 E12.5れている。（B）ウシ血清アルブミン浸したアガロースビーズ（明るい青）トランスウェル培養系で十二指腸に置いた。暗い青色の染色は、間葉系クラスター16。新たに採取したE14.0（C）の（CF）クロスセクション、E15.0（D）およびE16マーキングヘッジホッグレポーターマウス系におけるPTC のLacZ / +用のX-gal染色である。 0（E）、E-カドヘリン（緑）およびDAPI（青色）で染色した十二指腸組織。 E15.0およびE16.0で、発生期の絨毛が表示されている間にE14.0で、unremodeled上皮はまだ（F）、（C）に見られるものと同一の腸セグメントを多列されていますが、2日間培養した（E14 + 2日）は、わずかに遅れたものの、絨毛は、培養中に発症することを示している。パネル（CF）はウォルトンらから転載している。、2012 2 SUP>。スケールバーは50μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

E15.5のホールマウントPDGFRαEGFP / +腸からのz-スタックのステッチフィールドの図2三次元再構成画像は、部分的な再構築である（51μmの65のz断面の中心からのセクション）54ステッチ分野から倒立DMI 6000 LeicaSP5X共焦点顕微鏡の電動ステージを使用してキャプチャビューの900 nmでの二光子レーザー励起で立っている。ライカLAS-AFソフトウェアは、画像全体を形成するためにZ-スタックをステッチ。スケールバーは1mmである。

nは "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 51817 / 51817fig3highres.jpg "幅=" 500 "/>
E14の十二指腸における腸血管系のホールマウント抗PECAM免疫蛍光を示す光学セクションの図3三次元再構成。光のセクションは直立DMI 6000 LeicaSP5X共焦点顕微鏡で撮影した900 nmで二光子励起で立ち、三寸法的にImaris 7.6.1ソフトウェアを用いて再構成。スケールバーは200μmである。

ビブラトーム切片E15.5PDGFRαEGFPの図4。共焦点画像/ +; ROSA26 mTmG空腸がその上を覆う上皮と間葉クラスター（緑色）のPDGFRαEGFP / +細胞の密接な関連を示すと間充織を囲む（赤; Rosa26遺伝子mTmGから膜トマト）。< / strong>のスケールバーは、上のパネルが50μmと下のパネルにおいて25μmである。

染色された抗体免疫蛍光だったE15.5のビブラトーム切片腸からの共焦点画像を図5の三次元再構成。スケールバーは50μmである。

2光子ライブイメージングのためのトランスウェル培養系の6適応図。 （A）画面が培養皿に配置されるメッシュ。（B）ポリカーボネート膜はメッシュスクリーンに接着される。（C）腸のポリカーボネート膜に接着及びフェノールを含まないDMEM培地で培養する。

図2にE14の十二指腸におけるPECAM染色血管系の光学切片の3次元再構成を示すムービー2回転ムービー 。

著者らには開示すべき金銭的紛争はない。