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Summary

このレポートは、TriKinetics Drosophila Activity Monitorを使用してショウジョウバエの幼虫の活動を測定する方法について説明しています。このデバイスは、赤外線ビームを使用して、最大16匹の個々の動物の動きを検出します。データを分析して、アッセイチャンバー内の動物の速度や位置などの運動パラメータを表すことができます。

Abstract

ショウジョウバエの幼虫は多くの行動研究で使用されていますが、幼虫の活動の基本的なパラメータを測定するための簡単な装置は利用されていません。このプロトコルは、成虫の活動を測定するためによく使用される機器、TriKinetics Drosophila活動モニター(MB5 Multi-Beam Activity Monitor)を再利用して、幼虫の活動を研究します。この装置は、16本の8cmガラス製アッセイチューブ内の動物の動きを、1本あたり17本の赤外線検出ビームを使用して監視することができます。ロギングソフトウェアは、データをコンピューターに自動的に保存し、移動回数、センサーがトリガーされた時間、チューブ内の動物の位置などのパラメーターを記録します。その後、データを分析して、全体的な移動運動や位置の好み、およびその他の測定値を表すことができます。すべてのデータは簡単にアクセスでき、基本的なグラフ作成およびデータ操作ソフトウェアと互換性があります。このプロトコルでは、装置の使用方法、ソフトウェアの操作方法、および幼虫活動アッセイの開始から終了までの実行方法について説明します。

Introduction

遺伝的ツールとしてのショウジョウバエの使用は、生物学的システムの科学的知識を変革しました。ショウジョウバエの幼虫^は、侵害受容1、発生²、およびヒト疾患遺伝子^の研究3のモデルとして、さまざまな研究で使用されてきました。ショウジョウバエの活動は、温度²、薬物への曝露⁴、および異なる遺伝子型間を含む、さまざまな条件下で変化するさまざまな行動を包含しています。しかし、モデル生物として幼虫が大量に利用されているにもかかわらず、幼虫の活動を分析するための簡単で標準化された方法は利用されていませんでした。現在、多くの幼虫の運動研究では、高度なビデオ解析ソフトウェア⁵が採用されています。このような自動化ツールは強力ですが、その複雑さは、ロコモーションを研究する設備がまだ整っていない研究室が、有益な活動パラメータの分析を研究に含めることを躊躇させる可能性があります。グリッドクローリング分析などの他の現在の非自動化方法では、動きは人間の観察者によって採点されるため、主観性の可能性が生じ、スループットを一度に1匹に制限します^6-7。同様の研究では、幼虫が特定の^{直線距離を移動する}のにかかる時間を測定する5レーンのクロールアッセイを使用した8。このような非自動アッセイでは、変位が測定されますが、これは開始点と終了点の間の非線形移動を考慮していません。以下で説明するように、ここで説明する方法は、実際の幼虫の動きをより多く説明し、客観的で操作が簡単で、堅牢なスループットを提供します。

精度、効率、またはコストを損なうことなく、幼虫の活動行動を簡単に研究するために、この方法は、成虫の活動を研究するためによく使用される装置であるTriKineticsショウジョウバエ活動モニター（DAM）を採用しています。1つの装置を使用して成虫と幼虫の両方の活動を研究することは費用対効果が高く、これら2つのライフステージでの動物の動きを直接比較することができます。このシステムは、メーカーの最高レベルの分解能を特長とし、アッセイチューブあたり17本の赤外線検出ビームを利用し、16本の個々のチューブ内でセンサービームが切断されたときに幼虫の活動を記録します。その後、記録した情報をコンピュータに自動的に保存し、基本的なグラフ作成ソフトウェアで操作できるようにします。得られたデータは、個々の幼虫によって破壊されたビーム(速度に変換可能)、幼虫が検出器ビーム内に留まったときの動き、および記録期間中のアッセイチャンバー内の動物の位置(位置選好を計算可能)を表しています。このシステムは効率的で操作が比較的簡単で、ショウジョウバエの幼虫を研究するあらゆる研究室の手の届くところに再現性の高い基本的な活動分析をもたらします。

このアッセイの威力を示すために、周囲温度の変化による活性の違いを検証するためのその使用を示すデータ、および以前に低活性と記載された変異体(iav¹)⁹と広く分析された対照(w¹¹¹⁸)との比較を通じて提示されます。

Protocol

幼虫の調製

1. 移動や位置の好みのための所望の幼虫を分析するために、標準的なフライ食品^11を使用して^10を分析したい年齢に標準的な条件下で幼虫を育てます。
2. 漏斗の上にシルクスクリーングレードのナイロンメッシュを延伸してメッシュフィルタを作成します。ゴムバンド付きファンネルネックでメッシュを固定します。ビーカーに漏斗を配置します。
3. 分析のための幼虫を収集するには、へらフル培養瓶から採餌幼虫を含有する食品のスクープと絵筆¹⁰とメッシュから直接個々の幼虫を収集し、メッシュフィルター上でRTの水道水で洗います。

アッセイチューブの調製

1. アッセイチューブを接続するために準備するために、慎重に4％寒天ゲルを沸騰さ1.5センチの深さにシャーレに注ぎます。動物が封入されている場合に、チューブの両側のためのプラグインを提供します。 4％溶液は、pから幼虫を防止するために十分に密ですプラグをenetrating。
2. チューブは前幼虫の挿入にクリーンでクリアされていることを確認してください。そうでない場合、これは記録されないような動きを阻止することができます。
3. 幼虫が移動するのに十分な水分を持っていることを確認するために、少量のお湯を含むスクイーズボトルを準備します。シンクに向かう出口を向けると、撮像管から水を排出するために静かに絞る慎重に、ボトルを反転。
4. アッセイチューブにボトルの出口を挿入します。結露の薄い層がチューブの壁に表示さ​​れるまで、アッセイチューブに水蒸気を提供するために、ボトルを絞ります。ビデオ1は、水分の適切な量のチューブに移動する幼虫を示しています。
5. チューブ内の幼虫を密封するために、ペトリ皿から1.5センチメートル厚い寒天ゲルを除去し、寒天プラグをチューブの中に挿入することができるように、寒天の下に空気の流れを可能にするために、メッシュ表面の上に置きます。一方の端部にゲルの2つのプラグを挿入するために、二回ゲルにアッセイチューブの一方の端を押してください。
6. paintbとラッシュ、約1.5インチの深さのチューブに1幼虫を置き、寒天ゲル内に幼虫に最も近い端部を押してチューブをシール。得られた圧力は反対側の端部からの寒天ゲルの第2のプラグを強制し、チューブ内に動物をシールします。
7. プレイスMB5マルチビームショウジョウバエアクティビティモニタ（DAM）装置で、チューブ、および動物がセンサーの範囲を超えて移動できないように、チューブのポジションを調整します。
8. そのアッセイチューブは、輸送中にデバイスの赤外線読み取り枠の外にスライドさせないようにするには、それが接触する記録装置を各チューブの周りにパテのリングを固定することにより、所定の位置にチューブを保持します。

3.測定アクティビティ

1. インキュベータ内のレコード活性は、影、蛍光灯やラボ内の温度変化に発生することがあり、不正確な読み取りを防止します。システムの推奨構成については、図5を参照してください。
2. 20°C（ 図1参照）にインキュベーターを設定します。記録時に白熱光源からの干渉による誤記録を回避するために、蛍光インキュベーターライトをオフにし、インキュベーター内で記録しながら個別のLED光源を使用しています。光の状態が異常にセンサーを誘発しないことを確実にするために、任意の動物なしで裁判を行います。この試験の後に記録された運動データがあってはなりません。
3. 幼虫は、アッセイ開始前の5分間20℃のインキュベーターの設定に順応することができます。
4. 所望の記録間隔（ 例えば、1分）にDAMシステムを設定するには、DAMシステムレコーディングソフトウェアをコンピュータ^12をホストし、PSIUインターフェイスに記録チャンバーを接続する前にDAMシステム·ファイルを開くためにダウンロードされることを確認します。
5. 、データが保存される時に所望の記録周波数を設定し、選択優先し、次にそのデータを様々な時間枠を選択するための読書間隔オプションの上または下をクリックし保存されます。例えば、1時間に1秒からインターバル時間を読んで選択します。
6. 、データの記録に変化するパラメータを選択するプリファレンスを選択し、出力データタイプの下に対応するボックスを選択するには（カウント、移動、位置と住む、表1を参照）。各パラメータは、チューブ内の幼虫の活動のユニークな分析を提供します。
7. 録音を開始するには、CAB6の電話ケーブルを使用して電源インタフェースユニット（PSIU）にモニタを接続します。電源コンセントにPSIUを接続します。緑色のライトは、適切な接続を示します。
8. データ記録用のMacintoshまたはWindows PCにUSB（Universal Serial Bus）ケーブルを介してPSIUを接続します。自動的にデータの記録を開始するには、コンピュータのDAM SystemMB1v6xプログラムを開きます。
9. 所望の収集時間が完了すると、終了を選択し、その後DAMアクティビティ画面に現在終了。データは、自動的にDAMシステムデータで保存されます。このデータファイル（ 例えば 、1を監視）し、ドラッグしてください別のフォルダに。彼らは、後で処理できるようにこれは、DAMのソフトウェアからの生データを格納します。

処理のためのデータの準備4.（DAMファイルスキャン）

1. 理解しやすい形式に生データを処理するには、DAMファイルスキャンアプリケーションを開き、選択入力データフォルダを選択します。そして、データフォルダー、目的のファイルを選択して、スキャンオプションを選択します。最後に、所望の読み出し期間にビンの長さを選択します。これは、オペレータが設定したパラメータに生データを整理しますと、プログラムは、その特定の範囲内で収集されたデータを報告します。
2. 所望の動作設定（モニターの数、移動、住む）を分析するために、出力データ型を選択します。追加の測定値メニューの下で、ビンに選択合計（これはビンの長さが選択したシステムの読み取り間隔よりも大きい場合）。
3. 適切にファイルに名前を付けて保存します。ファイルには、ステップ3.9からのフォルダと同じ場所に保存されます。

_title "> 5。分析のためのデータへのアクセス

1. 以前に保存したファイル（ステップ4.3）を開き、平均移動、プロセススプレッドシートプログラムでテーブルを生成するには、手順4から生成された生データを収集するために、テキストインポートウィザード]ウィンドウが表示されたら、[完了]を選択し、開くためには、スプレッドシート形式のデータファイル。
   注：分析されたデータの種類に応じて、スプレッドシートは、異なって読み出されます。各個別の読書チューブが指定手紙を受け取ることになりますしながら、典型的には、モニタを移動または数を測定するために、研究の期間は、数値的に記録されます。スプレッドシートのデータを表示すると、列はそれぞれ、アッセイチューブ1〜16用のスロットを表すKZ。行は、収集されたデータ点を表します。
2. 移動は、1分間隔で20分間採取した場合、例えば、移動/分、他の測定値の平均値を計算するために20行を平均します。

Representative Results

図1は、7つの異なる温度での幼虫の運動の違いを検出するための監視装置を使用し^、1118ワット、制御3齢幼虫の温度応答試験の結果を示します。幼虫を洗浄し、上記のようにDAM活動装置に入れ、所望の温度に設定したインキュベーターに入れました。記録が開始される前に装置を5分間環境に順応させました。各幼虫を個別に20分間かけて移動するために分析し、毎分移動の平均数は、すべての動物について計算し、32匹の動物の各セットについて平均しました。データを分析し、表計算プログラムを使用してグラフ化しました。温度は20℃と25℃でのこのような傾向の中断を除いて、5度刻みで5〜35°Cからそれに対応して増加すると幼虫が大幅上昇活性を示しました。

違いはCOUていることを確認するにはLDを制御し、以前に低活動として記載の変異体との間で検出され、 非アクティブな幼虫（IAV ^1）を試験しました。データは、32匹の動物のそれぞれについて、移動/分として分析し、平均値を計算しました。 図2に示すように、分析は、 非アクティブな幼虫が対照よりも有意に少ないモバイルたことを示しています。彼らは3齢幼虫よりもはるかに小さいですが、図3に示すように、活性第一及び第二齢幼虫は、また、測定した。20分アッセイの各分に3齢幼虫の活動は期間を通して比較的一貫性を維持することが示されました（ 図4）。

¹¹¹⁸幼虫歩行W図1は、5℃から変化する温度で記録した- 。35°Cの電力EacHカラムは、セットの中で平均毎分個々の動きと32 3齢動物の平均運動を表します。 *すべての平均は10°Cと15°C（p = 0.116）（異なる文字はスチューデントのt検定、有意差を示す）を除いて、互いに大きく異なります。

20℃での非アクティブ （IAV ^1）幼虫に比べて図2. 3齢制御幼虫は対照と比較して有意に少ないモビリティを¹幼虫の出品IAV。

図各幼虫期は20℃である。N = 32 で20分の記録間隔で第一、第二、第三齢幼虫の活性の測定3。

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20分の記録間隔の各分に発生した動きの平均数を表示図4.ヒストグラムは32 3齢幼虫を20℃で検定しました。赤い線は毎分移動の数は全体の20分間隔の平均を表します。

ショウジョウバエアクティビティモニタのセットアップとPSIUインターフェース部とデス ​​クトップコンピュータとの接続を示す図5.図。インキュベータの内部が示されているが、インキュベーターを記録中に遮断されるようになっています。

説明	パラメーター
データを記録するたびに幼虫は、ビームを横断し、追加のカウントが記録されている幼虫が移動する場合は、単一のビーム内の一方。	カウンツ
フライは、別々のビーム間再配置するときにデータを記録するだけで、それがビーム内の動きを記録しません。	移動
記録間隔で各秒目の動物の位置を記録します。このデータは、分析の過程で、各センサで過ごした時間の関数としての位置設定を明らかにする。	ドエル
この設定は、動物が移動中にトリガされたセンサかを示す、チューブ内の動物の一般的な位置を解析します。	ポジション
この設定は、設定された時間枠の間に収集されたデータは、デスクトップコンピュータに保存された周波数を決定します。	記録間隔

measuの表1の説明rementパラメータ（カウント、移動、ドウェルおよび体位）。

ビデオ1 DAMシステムアッセイチューブ操作装置に挿入する前に。水分を呼気から凝縮によって提供されます。このレベルは、動物が浮いたり泳いさせることなく、試験期間を通じて幼虫の歩行を維持するのに十分である。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。

Discussion

ショウジョウバエ幼虫の活性は遺伝子型^8、13歳、周囲温度²を含む様々な要因によって影響されます。非常に詳細な分析が可能な強力なビデオグラフィック方法は歩行^5を研究者たちによって開発されているが、このレベルの詳細は、活動の基本的なパラメータを決定したい人のための余分な場合があります。ここで説明する方法は、多くの研究室で利用可能で、デバイスを採用し、操作が簡単であり、再現性の高い結果を生成し、さらにその一次調査の焦点移動はないもののために管理可能です。例の結果は、このアッセイは、異なる温度（ 図1）と異なる遺伝子型（ 図2）に付し幼虫における運動性に有意な変化を検出するために用いることができることを実証します。

それらの、35°C – 幼虫を5°Cの範囲の温度で測定したときに活性は、20°Cと25°C（ 図1）との間の傾向の中断を除いて、温度とともに増加しました。これは、採餌早期3齢幼虫は、典型的な25℃の培養温度の±2℃以内の温度を好むことエインズリーと共同研究者により示されています。幼虫は半ば3齢期をさまよう入力するときしかし、彼らはやや低い温度^2を好みます。その発見は、アッセイした動物の一部がより低い温度でよりアクティブに、そしてそれほどで放浪の段階にあったとことを示唆し、第三齢幼虫のための運動活性が25℃より20℃の大きい観察と一致します25°Cの通常の培養温度。

この方法はシンプルさ、客観性と堅牢なスループットを提供していますが、制限があります。現在のセットアップがPRしないため、上記のアプリケーションは、部分的には、比較的短い時間枠にわたって発生アッセイを表します食料源とovide幼虫。十分な栄養を確保することが長期間にわたって活性の変化を研究したり、長期的には概日リズムを測定することが必要であろう。 4％寒天プラグは低酸素状態を経験した幼虫をもたらす可能性がある、室と外部環境との間のガス交換を制限することができます。しかし、これは期間の毎分の間に幼虫の分当たりの平均移動を分析したとき、幼虫は記録期間にわたる活動の変化を示すように思われなかったので、20分のアッセイ期間内活性に影響を与えるようには見えない（ 図4） 。

デバイスレコードの位置が連続的に、それが引用した非自動化された方法と比較して、複数の動きを捕捉の改善を表しているので、しかし、いくつかの動きが検出を逃れるん。動物の非常に小さな動きが、このデバイスからの応答を誘発しない可能性があり、幼虫は1インフラ内周の方法で移動することができます不正確に低い読み取り値が得られ、隣接するビームを壊すことなく、赤色光。このタイプのエラーは、全ての処置群で発生することが予想されるので、それは誤った結果を引き起こす可能性は低いです。 3齢幼虫はこの分析の主要な焦点であるが、装置が非常に小さい第一及び第二齢幼虫同様（ 図3）の動きを測定することができます。予想されるように、若い動物で、毎分記録移​​動の数は、より大きな三齢動物のそれよりも低いです。

このデバイスの用途の全範囲を実証するためにまだ持っていますが、幼虫を含む研究のために、この装置の使用方法を多様化することができる他の適応の様々なものがあります。例えば、デバイスは、チューブの決定された領域に費やされた時間を表す「ドエル」の測定を可能にします。 A各種ショウジョウバエ幼虫タクシーに採用する場合に有益な情報を提供することができますssays。チューブが垂直の代わりに水平に配向されているように、その側に装置を配置することによって、人は幼虫走地性を測定することができます。走光性を測定するために、光の勾配は、幼虫が光やその不在のための好みを持っているかどうかをテスト、チューブ内に確立することができました。走化性を研究するために、被験物質を寒天プラグの上に配置することができ、幼虫の位置が、そのための好みや化学物質の回避を決定明らかにするかもしれません。

モニターシステムは、事前アッセイセットアップ中にすべてのパラメータを選択することにより、表1にまとめたさまざまな動きパラメータ、（ステップ3.6を参照）の分析を可能にする、実験者はアッセイ後に分析するためにどのパラメータを選択することができます。いずれかの設定が選択されていない場合は、そのデータは、 事後解析用には使用できません。これは、時間の各選択された期間の後、データが現在のカウントで凍結され、ホストコンピュータに保存されていることに留意すべきです。データ収集は、その後にリセットされますこの期間の後にゼロと時間間隔のデータポイントのシリーズを提供し、再び開始します。一つは、手動でデータの記録を終了するには終了する必要があります。

この方法を含む今後の研究は、滞留パラメータとその様々なアプリケーションの使用に焦点を当てます。また、それは試験食品を提供し、より多くの気体透過性材料¹⁴のための寒天プラグを交換することにより、そのような概日試験として、より長い期間にわたって起こることを可能にするプロトコルを開発することが可能です。乾燥条件は^、15移動^を阻害するような水分レベルは、同様に制御される必要があります。現在、このプロトコルは、実験的な様々な条件下で幼虫の活動の基本的なパラメータを評価するために正確な、シンプルでコスト効率の高い方法を提供します。

Materials

Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires	TriKinetics Inc. 	MB5
Power Supply Interface for Activity Monitor 	TriKinetics Inc. 	PSIU24
Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100)	TriKinetics Inc. 	PGT 5×80
DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel)	<a href="http://www.trikinetics.com/">www.trikinetics.com</a>		free download
DAMFileScan 108x software for Macintosh	<a href="http://www.trikinetics.com/">www.trikinetics.com</a>		free download
USB software (PSIUdrivers.zip).	<a href="http://www.trikinetics.com/">www.trikinetics.com</a>		free download
DAMSystem Notes 308	<a href="http://www.trikinetics.com/">www.trikinetics.com</a>		free download
Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope	Spectra Services	SP-STEMI2000C-BS
Carbon Dioxide	Maine Oxy		anaesthesia
Fly Pad	Genesee	59-114	surface for sorting anaesthetized flies
Small paint brush&nbsp;	Winsor &amp; Newton	#2 ROUND	or similar, used for sorting anaesthetized flies
Silk Screen Printing Mesh (160)	msj-gallery.com	SM160W63-3YD	pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm
Tegosept	Genesee	20-258	preservative
Ethanol (190proof)	Pharmco	111000190	used to dissolve Tegosept
6 oz Square Bottom Bottle (PP)	Genesee	32-130
"Flugs" for Plastic Fly bottles	Genesee	49-100
Drosophila Vials, Wide (PS)	Genesee	32-117
Flugs for wide plastic vials	Genesee	49-101
Yellow Degerminated Corn Meal	Gold Medal
Drosophila agar	LabScientific	FLY 8020
Baker's Yeast – Red Star	King Arthur Flour	1270
Granulated Sugar – Extra Fine	Domino