マルチ電極アレイ上のらせん神経節ニューロン外植片培養と電気生理学

世界保健機関によると、世界中で3億6000万人が難聴に苦しんでおり、仕事や私生活に深刻な影響を及ぼしています。補聴器は、中等度の難聴の感覚機能を回復させることができます。しかし、最も重症の場合、最も効果的な治療選択肢は人工内耳(CI)と呼ばれる補綴装置です。CIには、最大24個の電極からなる線形電極アレイが含まれており、蝸牛の鼓膜スカラに外科的に挿入されます。電極は螺旋神経節ニューロンを直接刺激し、聴覚神経¹を形成します。

世界中で300,000以上のデバイスが埋め込まれており、CIは非常に成功した医療用インプラントであり、これまでに報告された中で最も費用対効果の高い手順にランクされています。その成功にもかかわらず、人工内耳には、生理学的な聴覚と比較して周波数分解能が低下するなどの制限がまだあります。これは、グループや騒がしい環境での効果的なコミュニケーションや、音楽などの非常に複雑な音を解読する能力の不足につながる可能性があります。この周波数分解能の低下は、CI電極とらせん状神経節ニューロンとの間のギャップが原因であり、ニューロンの大きなグループの刺激につながる可能性があります。このギャップは数百マイクロメートル^{の範囲にあります2,3}。このギャップをなくすことで、電極当たりのニューロンのより小さなグループの刺激が容易になり、それによってデバイスの周波数分解能および全体的な性能が向上する4。

電極とニューロンとの間のギャップの影響と、さまざまな最適化された刺激プロトコルの影響を研究するために、私たちは多電極アレイ(MEA⁾⁵上のSGNの非侵襲的な電気生理学的特性評価に基づくin vitroバイオアッセイを開発しました。さらに、MEAは、電極の形状、サイズ、材料、表面粗さを変えるように簡単に変更でき、ニューロンと電極の界面を最適化することができます。以下は、マウスの螺旋神経節ニューロン培養から記録を再現性よく取得し、上記のパラメータへの依存性を評価するための段階的なプロトコルです。

動物のケアと実験はスイスの地方自治体（AMTエリーゼLandwirtschaftウントナチュールデKantonsベルン、スイス）のガイドラインに従って行いました。

1.実験のためのソリューションを準備

1. 氷上で解凍ECMミックス：細胞外マトリックス（ECM）コーティング液を準備（ 材料表、点6を参照してください）。 （神経栄養因子またはウシ胎児血清（FBS）なし）基本的な培養液中のECMミックス1:10に希釈し、氷上で保存します。
2. （ 素材表 、点1を参照）、培養培地を準備します。FBSまたは脳由来神経栄養因子（BDNF）を含有しないNeurobasal培地の株式を準備します。直前に細胞培養物に添加することに新鮮なFBS（10％）とBDNF（5 ngの/ ml）で神経基礎培地を補います。
3. （ 素材表 、ポイント2を参照）は、細胞外溶液を調製します。

MEAの2洗浄と滅菌

図1E）に配置された68の電極を含んでいます。各電極は、中心から中心までの200μmの間隔で40×40ミクロン^のサイズを有しています。電極は白金で作られています。電極は、インジウムスズ酸化物からなる回路により、対応するコンタクトに接続されています。この回路は、SU-8の5μmの層によって絶縁されています。プロバイダーの詳細については、資料の表を参照してください。他のMEAのレイアウトは、これらの実験のために適切であり得ます。

1. 新しいMEAについて：30秒間70％エタノールに浸漬することによって、それらをすすぎ、30秒間蒸留水で洗浄しました。層流フードで働いています。
2. 層流フード内で30分間、MEAの乾燥をしてみましょう。
3. 個々の滅菌ペトリ皿（35ミリメートル×10 mm）の中に、各MEAを置き、ホイルで密封します。使用するまでのMEAを保存することができます。
4. 中古のMEAについて：酵素solutの1ミリリットルを含むペトリ皿（35ミリメートル×10 mm）の中のMEAをインキュベートイオンは、生物学的物質を除去するために、室温でオービタルシェーカー上でO / N（ 材料表 、点6を参照してください）。そして、ステップ2.1のように続けます。
   注：ゴム被覆ヒントと鉗子を使用して注意してたMEAを取り扱ってください。

培養実験のためのMEAの調製

1. 密封箔を取り外し、実験全体のためのペトリ皿（35ミリメートル×10 mm）の中にMEAを残します。
2. コート1.1で調製した溶液とMEAが：全体の電極面積をカバーし、各MEAにコーティング液50μlをピペットする（-20℃で保存）冷たい200μlのピペットチップを使用してください。
3. 室温で30分〜1時間コートへのMEAを許可します。
4. ピペットを用いて塗布液を除去します。 10％FBS及び5ngの/ mlのBDNFを補充した培養培地100μlを適用し、組織をメッキするまで室温でそのままにしておきます。
5. 大きなペトリ皿（94ミリメートル×16 mm）の中にコーティングされたMEAを含む2ペトリ皿を置き、1.5を含む第3の小さなペトリ皿を追加加湿用リン酸緩衝生理食塩水（PBS）のミリリットル。
   注：PBSを含む小さなペトリ皿（ステップ3.5）を追加すると、大幅に培地の蒸発を最小限にすることが重要です。

4.らせん神経節郭清

注：グロス解剖は、層流フード（ステップ4.1〜4.4）の外に行うことができます。細かい解剖無菌状態（層流フード）の場合（ステップ4.5から）は必須です。

1. 前麻酔なしで断頭により、動物（5-7日齢のマウス）を安楽死させます。
2. 70％エタノールを噴霧することによりヘッドを滅菌します。
3. ヘッドを保持することにより、皮膚と子線に沿ってシャープ/シャープはさみと頭蓋骨の間の接続を切りました。
4. 矢状に頭蓋骨をカットし、シャープ/鈍いはさみを使って脳を削除します。
5. 頭蓋骨から頭骨をカットし、無菌氷冷ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を含有するペトリ皿のものを置きます。
6. dissecを使用しましたション顕微鏡は、微細な鉗子を使用して鼓膜水疱を分析し、内耳を分離します。
7. 細かい鉗子を使用して、蝸牛の骨を削除してください。
8. （SV）を一緒にピンセットで螺旋状神経節（SG）とSVの基底部を保持し、ゆっくり-頂点-toベースからSVを巻き戻すことにより、スパイラル靭帯および血管条を削除します
9. コルティ（OC）の器官、SG及び蝸牛軸（ - C 図1A）を単離し
10. 鉗子でSGとOCの基底部を保持し、ゆっくりとベース - 頂点からOCを巻き戻すことにより、SGと蝸牛軸からOCを区切ります。
11. まだ鉗子やマイクロメスを用いて蝸牛軸（ 図1D）に取り付けられた螺旋状神経節から横方向外植片（直径200〜500μm）をカットします。

多国間環境協定5.らせん神経節外植片培養

1. 以前に10を用いて調製したMEAの電極に次の二つのらせん神経節外植片を置き培地の0μlの。
2. 約5mm離れた電極領域からコルチ器官を置きます。
3. 組織を損傷回避しながら、MEAの上に外植片とコルチ器官を固定するために鉗子を使用してください。
4. 慎重に37℃のインキュベーターや文化へのMEAを置き、5％のCO _2。翌日、視覚的に外植片がMEAに添付されていることを検査します。
   注：外植片は、O / Nを添付していない場合、彼らはめったに次日間にわたってそうしません。 OCは、栄養/神経栄養サポートのための文化に隣接して配置されています。
5. 5日間連続して毎日、10％FBSおよびBDNFを含む培地100μlのを追加します。
6. 6日目に、追加の13日間、10％にFBS及び5ngの/ mlのBDNFと文化組織を含む培養培地の2ミリリットルを追加します。

6.電気生理学的記録は、自発的かつ電極刺激依存的活性を調べるために、

1. 外でMEAの文化を洗うので、リューションはRTで、ステップ1.3で調製しました。
2. 組織との接触を乾燥させ、MEAの設定にMEAをマウントします。
   注：文化への細胞外溶液の小滴を追加し、実装時の湿度の高い文化を維持するために。
3. 細胞外溶液の300μlを添加して、システムを安定させるために、記録する前に10分間待ちます。
4. ソフトウェアの記録/取得]ボタンを押して、すべての電極から2分間のレコード自発活動と記録電極を特定します。
5. MEAの電極刺激：適切なソフトウェア上の刺激の振幅/期間/図形を選択し、連続していくつかの電極に適用されるとして^13を説明しました。 （ステップ6.4のように）自発的活動を示すものに基づいて電極を選択します。残りの電極の全てからレコード。
6. 刺激アーティファクトを除外するには、同一の電極から10回を刺激します。培養は10回のうち少なくとも8を応答した場合、それは次のように想定することができます電極誘導刺激時の肯定的な反応。
7. バックグラウンドノイズを識別するために、2分間の電位依存性ナトリウムチャネルとレコードをブロックするために、cultureatに1μMの濃度をテトロドトキシン（TTX）を適用します。スパイク検出（7.1および7.2）を実行するために使用します。

7.データ解析

注：データ分析は、先に^図6及び⁵に詳細に記載されています。この研究で使用されているソフトウェアに関する詳細については材料表 、点7は、参照してください。

1. 適切なソフトウェアを使用すると、標準偏差とその後の弁別に基づく検出器を採用し、各電極のための自発的な活動を検出します。この手順⁶に記載されています。活動は、高速過渡電圧（<5ミリ秒）が表示されます。
2. 偽positivとを区別するために、各実験のためにsamples.Adaptにしきい値をあしらったTTXを分析する際に全く活性になるしきい値を選択してくださいeおよび偽陰性検出。
3. 適切なソフトウェアを使用すると、（ - C 図2A参照）標準的な手順に従って、ラスタプロットとして、各電極の検出ニューロン活動を観察します。
4. 決定し、1ミリ秒のステップだけシフトさ10ミリ秒のスライディングウィンドウ内で検出されたすべてのイベントを、合算して総ネットワークアクティビティを表示します。
5. 適切な解析ソフトウェアを使用して生データを表示することにより、刺激によって誘発される活性を検出。手動でオフラインで単一スパイクを識別します。シングルスパイクは、刺激アーティファクト（ 図2Eの矢印ヘッド）後に発生する、などの高速過渡電圧を表示されます。例えば、 図2Eに示されています。
6. 実験に応じて、応答する電極の数、応答を達成するのに必要な閾値、電極及び関心⁵の他のパラメータごとに活動電位の数を分析します。

8.組織固定とイムunohistochemistry

注：染色工程は、MEAを破壊します。試薬のための材料表 （ポイント4）を参照してください。

1. 直接記録した後、37℃の温PBSで三回文化を洗います。 PBSを捨て、10分間37℃に予熱し（PBS中）の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で、適用します。
   注意：PFAは有毒です。ガイドラインに従って適切な保護および廃棄溶液で化学フードで働いています。
2. PBSで培養物を3回洗浄し、2時間、PBS（0.01％のTriton-X100）中の2％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックします。
3. PBSで希釈した一次抗体（抗βIIIチューブリン、TUJ抗体）を追加（2％BSAおよび0.01％のTriton-X100）と4℃でO / Nを残します。 PBSで培養を3回洗浄します。
   注：今から上の二次蛍光標識抗体の退色を最小限に抑えるために、できるだけ頻繁に暗闇の中でサンプルを維持します。
4. PBSで希釈した二次抗体を加える（2％BSAのAND、0.01％のTriton-X100）と室温で1〜2時間インキュベートします。 10分間万DAPI（1mg / mlのストック）：染色核に1を追加します。
5. PBSで3回洗浄し、（ 材料表 、点4を参照）マウンティング培地を用いて、薄いカバースリップ（24×50mmの^2）に後方にサンプルをマウントします。 5Xおよび20X倍率で蛍光顕微鏡を用いた画像。

図1は、MEA上の組織分離、準備と文化のための手順をまとめたものです。私たちは、コルチ（OC）と血管条（SV）の器官の感覚上皮から螺旋状神経節（SG）を単離するために組織切開の連続したステップを示し、スパイラル靭帯を併合（ 図1 A - C）。模式図1Dに示されており、電極占有面積（2.2ミリメートル2）の上に、MEA（ 図1E）上に配置されたとして、らせん神経節外植片（数3-4）神経節からマイクロハサミで切断されています。 OCは、電極表面の外側に、近接して配置されています。培養物の成長は、時間（ 図1G）でモニターすることができます。プロトコルの概略図を図1Fに示されています。電気生理学的活性は、長期培養時間と共に増加培養の6日後に検出することができます。我々はrをecommend早い時間点5と比較して、記録電極の有意に高い数値を生成18日培養を評価します。

図1.細胞培養調製物。（A）新たに解剖し、マウス内耳。白のラインが黒破線は前庭領域を示し、蝸牛の位置を示す点線。 （B）蝸牛骨壁を除去した後のマウス内耳。蝸牛ターンが白い点線で示されています。 （C）スパイラル神経節（SG）と蝸牛軸、コルチ器官（OC）と血管条（SV）とスパイラル靭帯を解剖後に示されています。 （D）SGおよびOCの解剖とSG外植片の準備{出版社からの承認を得て5から適応図}の概略図。本研究で用いたマルチ電極アレイの（E）イラスト。再符号化電極は中央に矩形グリッドに編成し、2.2ミリメートル2の面積を占めるています。 4接地電極と、側コンタクトが示されています。培養プロトコルの（F）回路図。記録は、18日目（G）代表の写真（明視野像）と1日目、6および18スケールバー= 400μmのように培養液でモニターMEA上のSG外植片の方式で行われている。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。

自発的な活動は、MEAに検出され、プロットの各ラインが検出されたスパイクを表すラスタプロットとして示すことができます。いくつかの電極（図中の異なる色）から検出された自発的活動を示す代表的な例は、（ 図2A、2B、および2C）が示されています。

図2D）刺激のために使用される二相パルスを示す代表的な例は、5応答電極（赤トレース）と非応答電極（青のトレース）は、図2Eに示されています。これらの実験のために一方の電極は、刺激および記録のためのすべての他の電極に使用しました。単一の活動電位は、刺激アーティファクト（黒矢印ヘッド）の後に1ミリ秒が登場しました。 MEAは、電極面積にわたる神経突起の被覆率を評価するための手順の最後で免疫染色することができます。 図2Fで緑色で示されている電極は、刺激のために使用し、赤色で示されている電極は、応答（ 図2E）を記録するために使用されました。

MEAの図2.データの録音。（</ strong>の）自発的活動を示す6 63のうち電極のオリジナル音源の痕跡。 （B）スパイク検出後の図2Aの6つの電極のラスタープロット。各バーは、一活動電位を表します。全ての電極活性（AおよびBなど）を含む（C）ラスタープロットは、2分間の63の電極（チャンネル番号0-63）から記録されています。 （D）の合計80マイクロ秒の持続時間と80μAの振幅に二相性刺激は、一方の電極（ 図2FにおけるE58）からの培養を刺激するために使用しました。 （E）または刺激後の応答（青トレース）することなく、電極の活動電位（赤トレース）を示す58から刺激した後に得られた生データのトレースの代表例（黒矢頭）。神経を可視化する実験終了時（F）ニューロンマーカーTUJ（緑）について免疫MEA上のらせん神経節文化電極面積の最終カバレッジは{図は、出版社からの承認を得て5から適応しました}。刺激のために使用される電極58が緑色で表示され、応答電極は赤で示されています。スケールバー=50μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

最後に、MEAのセットアップは、記録感度を向上させることが可能な電極の表面改質を研究することができます。厚さ150nmのPt層（インピーダンス：400KΩ/ 1キロヘルツ）からなる、グレープラチナ（グレーのPt）：2つの市販されているMEAの電極は、2つの異なるプラチナ表面と、この研究で使用したとブラックプラチナ、（黒、白金）、マイクロ製造プロセス（20KΩ/ 1キロヘルツインピーダンス）の端部に白金の電気化学的堆積によって得られます。詳細については、 材料表 （ポイント6）を参照してください。

黒のPt電極対グレーの図3の比較。電極の二つのタイプ（グレーと黒のPt）は、各MEAのタイプに12の独立したMEAの文化、6を使用して、並べて比較しました。 （A）再総数実験ごとsponding電極が示されています。 6つの独立したMEAの実験において30〜35の独立した電極対を用いて測定した（B）の応答を誘発する振幅閾値が、示されています。データは、平均+/- SDとして示されています。 （スチューデントのt検定p <0.001） 。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。