エレクトロポレーションによる齧歯類坐骨神経内のシュワン細胞へのインビボ遺伝子導入で

末梢神経系における感覚および運動情報の急速な伝達は、ミエリン鞘によって可能にされます。これは、髄鞘形成シュワン細胞（^{SCs）によって}形成されます。ミエリン鞘による軸索の絶縁は、塩性伝導を可能にし、神経インパルスの速度を増加させます。ミエリン鞘の発達または維持が損なわれている障害では、神経伝導速度が低下します。これにより、運動機能障害や感覚機能障害を伴う神経障害を引き起こします。末梢神経系における髄鞘形成と脱髄の分子メカニズムについては多くの研究が行われていますが、これらのプロセスに関与する多数のタンパク質の役割は不明のままです。

生体内でのSC髄鞘形成/脱髄の分子メカニズムを研究するために、遺伝的アプローチが動物の遺伝子発現を改変するために使用されてきました。強力なアプローチは、ノックアウト/ノックイン動物またはトランスジェニック動物の使用です。しかし、これらの動物の世代は高価で時間がかかります。SC特異的な遺伝子操作には、フロックス株とCreマウスの交配などの条件付き遺伝子発現法が必要です。これもまた、面倒で時間がかかります。近年、最先端の遺伝子技術であるCRISPR-Cas9システムにより、遺伝子改変マウスの作出が格段に早く(約4週間)^2,3されていますが、この方法では標的配列の制限が妨げられ、オフターゲット効果に悩まされています。代替法として、ウイルスベクター媒介遺伝子導入は、in vivo^4-6でSCへの遺伝子導入を達成するためのより迅速で容易な方法です。実際、ウイルスベクターの作製は安価で、所要時間も短く(数週間以内)、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レンチウイルスベクターなどの遺伝子ベクターを坐骨神経に注入するだけで、SCの遺伝子操作を実現できます。これらのウイルスベクターは異なる特性を持っているため、ユーザーは自分の目的に最も適したものを選択する必要があります。アデノウイルスベクターは、若年および成熟した坐骨神経の軸索およびSCに感染します。特に、アデノウイルスベクターは、髄鞘化SCよりも非髄鞘性SCに対して選択的に高い位置を持っています。アデノウイルスは免疫応答を引き起こす可能性があるため、免疫不全株を使用する必要があります⁵。AAVベクターは、現在最も広く使用されているウイルスベクターであり、毒性の低いin vivo遺伝子導入を可能にします⁷。AAVは、神経線維^8,9への直接注射により、軸索とSCの両方を形質導入することができる。しかし、AAVを介したタンパク質発現は、通常、最大レベルに達するまでに3週間以上かかります^7,9。そのため、生後2週間の期間に活発に進行する髄鞘形成の解析は困難です。レンチウイルスベクターは、非髄鞘性SCよりも有髄性SCに対する選択性が高く、坐骨神経に毒性作用を及ぼさない。しかし、レンチウイルスベクターは、より成熟した神経5のSCに感染しないため、脱髄プロセスなどの事象の解析には適していません。

エレクトロポレーションは、生体内の遺伝子導入を達成するためのもう一つの迅速で簡単なアプローチです。エレクトロポレーションを切除したラット坐骨神経¹⁰に適用すると、SCのin vivoトランスフェクションを達成できることが報告されている。しかし、この方法では遺伝子導入のために神経切断が必要なため、損傷した神経の解析にしか適用できません。ここでは、エレクトロポレーション¹¹を用いて、無傷のラット坐骨神経の髄鞘SCに導入遺伝子を送達することを可能にする代替方法を説明する。この方法ではプラスミドの構築が必要ですが、通常は1週間以内に完了します。その後、プラスミドDNAが注入された坐骨神経の部位に電気パルスを送達するだけで、髄鞘性SCの高度に選択的なトランスフェクションを新生児だけでなく、より成熟した動物でも達成できます。複数のプラスミドをエレクトロポレーションすることで、様々な遺伝子の同時発現を容易に実現することができます。シグナル伝達タンパク質、ショートヘアピンRNA(shRNA)、機能プローブなどの複数の分子を同時に発現させる能力は、髄鞘形成や脱髄などの複雑なプロセスを研究するために重要です。この論文で説明した新しいin vivoエレクトロポレーション法は、研究者が多数の分子の機能と髄鞘形成SCにおけるそれらの相互作用を解析することを可能にする強力なツールとなるでしょう。

研究のためのラットの使用は、東京大学の動物福祉委員会によって確立されたガイドラインに従いました。

プラスミドDNAの1.Preparation

1. 哺乳動物細胞¹²発現プラスミド中のcDNAまたはshRNA配列をサブクローニングすることによってin vivoでエレクトロポレーションのためのDNAプラスミドを生成します。それは強く、安定した発現を可能にするため、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーターの融合（CAG）プロモーター駆動プラスミド^13を使用^してください。 CAGプロモーターの制御下でshRNAの発現のために、shRNAの^14をサブクローニングのためにmir30ベースのshRNAカセットシステムを使用しています。
2. 製造元の指示に従ってマキシプレップキットを用いてプラスミドDNAを精製し、HEPES緩衝生理食塩水（140mMの塩化ナトリウム、0.75ミリモルのNa ₂ HPO _4、25mMのHEPES、pHは7.40）でDNAを再懸濁します。 μgの/μLを≥4するDNAの濃度を調整します。
注：プラスミドDNAの最適組成は、各プラスミドのトランスフェクション効率に応じて決定されるべきです。

手術器具および生理食塩水の2滅菌

1. オートクレーブ手術器具および0.9％NaCl溶液。

ガラスマイクロピペットの調製

1. ピペットプラーを用いてガラスピペットを引き出します。 30-50ミクロンの直径にピペットの先端をカットします。以下のパラメータを使用します。熱、600;ベロシティ、50;時間、75。

4.動物の手術、DNA注射とエレクトロポレーション

注：オーバーこの手順の図は、 図1に記載されている。仔ラットの手順は、ここに記載されているが、この方法は、同様の手順を使用して、より成熟した動物にも適用可能です。

1. 動物は4％（体積/体積）に0.4リットル/分およびイソフルラン濃度に酸素流量を調整することで不動になるまで、インダクションボックス内のイソフルランでラットを麻酔。適切な麻酔を確認するためにピンチつま先を実行します。
2. 双眼顕微鏡下で予熱した暖かいにラットを入れ、かつ連続的にフェイスマスクを介してイソフルランを投与することにより麻酔を維持します。 0.2リットル/分および2％（体積/体積）にイソフルラン濃度に酸素流量を調整します。目は動物の目が開いている場合は、目の乾燥を防ぐために廃棄し使用します。
3. 外科手術用テープで足を固定してください。
4. ポビドンヨードと後部大腿部の皮膚をきれいにし、メスで切開を行います。
   注：外科的領域が時間で覆われている場合は、外科的領域を剃ります空気。
5. 大腿四頭筋の間に開口部を作成することによって、坐骨神経を露出すると、筋肉や上腕二​​頭筋が縫い針で筋肉大腿大腿。
6. 0.9％NaCl溶液で神経を濡らします。リントフリーペーパーで余分な水分を吸収します。
7. フレキシブルチューブの上にガラスマイクロピペットの基部を挿入して、静かに吸引することにより、マイクロピペットにDNA溶液（少なくとも1マイクロリットル）の適切な量を記入してください。
8. そっと針を用いて神経の先端側を引っ張ることで露出した神経を持ち上げます。
   注意：機械的ストレスを最小限にするために神経に緊張を与えないでください。
9. 神経の遠位部位にガラスマイクロピペットを挿入し、（フレキシブルチューブの開放端部に吹き付けることによって）圧力を適用することによって、DNA溶液を注入します。神経が緑（1μlの最大値）が表示されるまでDNA溶液を注入します。マイクロピペットの頻繁な挿入が神経を損傷することがあるので、倍以上のマイクロピペットを挿入しないでください。
10. TWEを配置離れて神経1〜2ミリメートル程度エゼル型白金電極。電極と0.9％NaCl溶液で神経の間のギャップを埋めます。
    注：神経への機械的ストレスを避けるために、電極と神経を持たないでください。
11. 電極とエレクトロを使用して、注射部位に電気パルスを適用します。最初のパルスセットした後、電極を反転し、別のパルスのセットを適用します。以下のパラメータを使用します。電圧、50 Vを、パルス持続時間、5ミリ秒。パルス間隔、100ミリ秒。パルス数、4回。
12. 0.9％NaCl溶液でエレクトロポレーションサイトを清掃してください。
13. 繰り返して、反対側の坐骨神経に4.4から4.11繰り返します。

5.ポスト​​エレクトロポレーション

1. シアノアクリレート接着剤で切開を閉じます。
2. 接着剤を乾燥させた後、ポビドンヨードで傷口をきれいに。
3. フェイスマスクから子犬を解放します。それは完全に麻酔から回復できるようにするために、時間の少なくともウォーマーに子犬を温めます。 Dそれは十分な意識を取り戻したまでO子犬を無人のままにしません。
4. 麻酔から回復した後、母ラットに子犬を返します。完全に回復するまでの子犬を返さないでください。

6.手術後

1. 実験^11を行うまで、ケージの住宅仔ラット（ 図3の例を参照してください）。カルプロフェン投与（5 mgの/ kgで、腹腔内）、非ステロイド性抗炎症薬、またはブプレノルフィン（0.1ミリグラム/ kg、皮下）、オピオイド鎮痛薬、必要に応じて。
   注：ラットの子犬が十分に成長しないか、炎症が手術部位付近に観測されている場合は、実験から動物を除外します。

プラスミド発現性赤色蛍光タンパク質（RFP）でトランスフェクトした坐骨神経の例は、図2Aに示されています。双極性形態を示す細胞は、SCの特徴は、まばらにRFPをトランスフェクトしました。いいえRFPの蛍光は軸索で検出されませんでした。我々は通常〜すべての神経で100トランスフェクトのSCを見つけます。このトランスフェクション効率は、レンチウイルスベクター4を用いたin vivo SC感染効率に似ているようです。

免疫染色実験は、ほとんど（〜96％）P7のS100、SCマーカー（ 図2B）のための共同標識し、P14のでRFP陽性細胞の91％MBPのための共同標識、髄鞘形成のSCマーカーでRFP陽性細胞（ 図2C）、エレクトロポレーションによる遺伝子導入は、SCのを髄鞘形成するための高度に選択的であることを示唆しています。

SCへの複数の遺伝子の導入<ein vivoでのmは>髄鞘形成/脱髄のメカニズムを調査するために非常に有用であろう。ここに記載のin vivoエレクトロポレーション法の主な利点は、簡単な手順で複数の遺伝子を導入するための能力です。図2Dは​​、in vivoエレクトロポレーションに使用して、GFPおよびRFPを発現するプラスミドの混合物を用いてトランスフェクト坐骨神経の代表画像を示しています。 SCの約97％は、複数の遺伝子の非常に効率的な送達は、単に複数のプラスミドの混合物をエレクトロポレーションによって達成することができることを示唆し、二重陽性GFPおよびRFPました。

げっ歯類では、ミエリン形成が劇的生後最初の2週間の間に増加し、出産の周りに開始し、その後徐々に減少します。このように、遺伝的にこれらの発達の時間窓の間のSCを操作することによって、髄鞘形成のこれらの異なる段階のメカニズムを明確にすることができます。レンチウイルスベクターはのための良いツールです彼らは最小の毒性を持っている、特にとして、髄鞘形成をnalyzingが、レンチウイルスは唯一の新生児の坐骨神経の5,6に感染します 。トランスフェクションは（ 図2E、下）P3（ 図2E、上）またはP14に実施された場合と比較して、エレクトロポレーション媒介遺伝子導入はうまく動作します。

生体内エレクトロポレーション法における新規のアプリケーションがここで説明されている。 図3Aは、GFPを発現する種々の発生段階（P7、P14、P21とP31）で、ミエリン形成のSCの光学顕微鏡像を示します。光学顕微鏡分析により、そのような長さと直径との形態学的パラメータの変化を評価することができます。これらのパラメータは、エレクトロポ神経が重大な損傷を及ぼすことなく開発することを示唆し、無傷のラット末梢神経15,16と比較して同様の値を持っていることに注意してください。 図3Bは、LacZをexpreの電子顕微鏡像を示しますミエリン化のSCをssing。この場合には、LacZの発現をマーカーとして使用しました。 bluo-galを、エタノール不溶性基質を用いて、βガラクトシダーゼ染色、電子顕微鏡11,17によりトランスフェクトされたSCのミエリン構造の解析を可能にします。これらの実験では、シグナル伝達分子の役割は、それによって、機能喪失または機能獲得型の影響の分析を可能にする、それらの発現をサイレンシングするか、増強することによって調べることができます。固定組織の分析に加えて、 インビボでのエレクトロポレーション媒介遺伝子移入はまた、イメージング実験をライブに適用することができます。例えば、 図3Cは、G-GECO1.1 18、緑色蛍光細胞質ゾルのCa 2+インジケーター、およびR-GECO1mt 19、赤色蛍光ミトコンドリアのCa 2+指示薬を共発現ミエリンSCを示しています。これらの指標を発現することによって、我々はのSCのミエリン形成にサイトゾルおよびミトコンドリアのCa 2+濃度を制御するシグナル伝達経路を同定し 。したがって、本発明の方法は、遺伝的にコードされた蛍光プローブは、関心のある信号を検出するために利用可能である場合は特に、シグナル伝達機構の種々の研究に使用することができます。

図 1：I Nインビボ 電気穿孔方法 の概略まず、麻酔したラットの坐骨神経を露出させます。第二に、プラスミドDNAは、坐骨神経に注入されます。第三に、電気パルスは、鉗子状の電極を介して注入部位に送達されます。最後に、傷は接着剤で閉じられています。この手順では、反対側の神経に繰り返すことができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図 3：in vivoでの エレクトロポレーション （A） のアプリケーションのSCをミエリン形成の発展の光顕微鏡分析。坐骨神経はP3でのGFP発現プラスミドをエレクトロポレーションした、と様々な発達段階（P7、P14、P21とP31）で固定しました。 GFP陽性SCの代表的な画像は、左側に示されています。平均長さと直径は、（n = 3の平均±SEMとしてまとめられています右側の3神経）47から0。開発が進むにつれてのSCが増加するミエリン形成の長さと直径。 （B）をコードするプラスミドのLacZでトランスフェクトされた坐骨神経の電子顕微鏡像。 （左白アスタリ​​スク）トランスフェクトされたSCが細かくβガラクトシダーゼ反応生成物の析出物で標識しました。 （C）G-GECO1.1、緑色蛍光細胞質ゾルのCa 2+インジケーター、およびR-GECO1mt、赤色蛍光ミトコンドリアのCa 2+指示薬で同時トランスフェクションSCの画像。白い点線の長方形内の領域は、右側のパネルに拡大して示されています。スケールバー=50μmの（AおよびC） 1ミクロン（B）。この数値は、当社の以前の出版物11から変更されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。