網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-Seq

ニューロンの多様性は、中枢神経系、特に網膜前駆細胞^1,2,3の1つの集団から生じる1つの神経膠細胞型および6つのニューロン細胞タイプからなる高度に特殊化された組織である脊椎動物網膜において観察される。細胞の多くのサブタイプは、機能的、形態学的および遺伝的に分類することができる。このプロトコールの目的は、細胞型の遺伝的変異性をそれらの同定可能な機能的および/または形態学的特徴と結びつけることである。多くの遺伝子が細胞の分類のために同定されているが、多くの亜型は、全体集団のわずかな部分しか表さないので、特徴付けされていない。これらの特定のサブタイプ内の遺伝子の同定は、網膜内のニューロンの多様性のより大きな理解を可能にし、また、他の場所での神経細胞の多様化を明らかにする可能性がある。フーさらに、単細胞研究は、全細胞集団のうちの低い発現のために見過ごされた可能性のある新しい細胞タイプの発見を可能にする。4,5,6,7。

単一細胞トランスクリプトミックスの利点の1つは、特定の細胞亜型を定義する独特のマーカーまたはマーカーの組み合わせが発見され得ることである。これらは、異なる操作のためにその細胞型に遺伝的にアクセスするために使用することができます。例えば、我々は、このプロトコールを使用して、光色素メラノプシンを発現する網膜神経節細胞のサブセットの細胞型特異的遺伝子を特徴づける。メラノプシン発現網膜神経節細胞における蛍光マーカーの使用は、既知の遺伝子の発現のために一緒に集まっているので、これらの細胞の研究を可能にする。興味深いことに、この細胞集団の5つの既知のサブタイプが存在するマウスの網膜^8にある。したがって、各タイプの細胞からRNAを単離するために、トランスジェニックモデル内に確立された形態学的分類を使用して、細胞分離の前に各サブタイプを同定した。この技術は、細胞内のストレス応答と切断された樹状突起によるコンタミネーションを引き起こす可能性のある組織の解離を必要とせずに、細胞の特徴付けと網膜からの直接的な分離を可能にする。

RNA-Seq法が発展しているので、ここ数年の間に数多くの新しい技術が明らかになりました。これらのツールは、手作業4,7,10,11,12,13の問題に近づいている間に、最大の細胞獲得とより高いコスト効率を可能にします。しかし、これらの技法は優れた踏み台になっていますが、このプロトコルが対応できる多くのハードルがあります。第1に、現在の手順の多くは、解離した組織から細胞を単離し、主成分分析または事後的な階層的クラスタリングのいずれかを用いて細胞分類を決定しようと試みる。これらのツールを使用してサブタイプを分類することは、信頼できる結果をもたらさない可能性があり、遺伝子マーカーと機能的細胞タイプとの相関についてこのデータを検証する新しい方法を見つけ出す可能性があります。他のプロトコールでの解離の必要条件は、組織損傷を引き起こし、神経突起を切断してmRNAの潜在的な消失を引き起こすことがある。さらに、解離した細胞調製物において、ストレス応答は、これらの細胞の転写物に影響し始める可能性がある¹⁴ 。このプロトコルは、分離の前に機能的細胞型を決定することによってこれらの課題を克服し、h網膜組織を無傷に保つことによって細胞の恩恵を受ける。

1つの手法が2014年に導入され、生きた細胞のトランスクリプトームのインビボ分析で構成されていました¹⁵ 。この技術は、組織への機械的破壊を最小限に抑えてトランスクリプトームの検査を可能にするが、非常に特異的なレポーターマウスを用いることなくトランスクリプトームを調べる前に組織内の特定の細胞型を分類する能力が欠けている。私たちのプロトコールでは、特定のレポーターは必要ありません。細胞を分離して分離する前に、細胞の充填と電気生理学を利用するためです。この以前のプロトコールのもう一つの制限は、光活性化可能なエレメントを励起するために特定の波長を必要とするということであるが、我々のプロトコールは、容易に入手可能であるかまたは各ラボで個別に選択できる蛍光レポーターおよび蛍光染料の使用を可能にする。それでもなお、他の研究所は、電気の2つの方法細胞多様性研究のための生体生理学およびトランスクリプトミクス。分離の前に細胞の機能を特徴づけるためのパッチクランプ記録の使用は、解離したニューロン¹⁶で実施され、場合によっては、これらの研究のためにマイクロアレイ分析^17の使用に先行していた。それらが組織解離または利用可能なプローブへの試料のハイブリダイゼーションに依存するマイクロアレイ技術の使用を必要とするので、それらのアプローチによって同じ合併症が生じる。最新の進歩の1つは、パッチクランプ記録とRNA-Seq技術を組み合わせて全脳スライス^18の細胞を理解するPatch-Seqの開発です。この手法はここに提示されたプロトコールと類似していますが、我々のアプローチでは、細胞の健康のために組織を無傷のままにすることができます。ここでは、最適化のためのプロトコルを提示するこれはRNA-Seqを使用して高い読み取り深度とマッピングカバレッジを得るための高品質の単一細胞ライブラリーを生成します。

すべての手順は、ノースウェスタン大学の機関動物管理委員会（IACUC）によって承認されました。

電気生理学のための溶液の調製（4時間）

1. 十分に混合し、混合物を室温（RT）で1時間インキュベートさせる。0.1％DEPC処理H ₂ Oを、ジエチルピロカーボネート（DEPC）1mLを逆浸透精製H ₂ O 999mLに加えることによって調製する。次に、DEPC混合H ₂ Oを液体サイクルで15分間オートクレーブする。 DEPCで処理したH ₂ Oを室温で冷却させる。
2. 1LのH ₂ Oにエイムズ（Ames）培地1リットルと重炭酸ナトリウム1.9g（23ミリモル）を混合して細胞外溶液を調製する。細胞外溶液を
   95％O ₂ /5％CO ₂で洗浄し、それをpH7.3~7.4に維持する。
3. 125mMのK-グルコン酸、2mMのMgCl 2、10mMのEGTA、10mMのHEPES、および0.1％のDEPC処理したHを組み合わせることにより、細胞内溶液を生成する-20℃で1 mLアリコートで保存する。各実験の開始時に10μMの蛍光トレーサーを加える。
4. 4.15mLの細胞外溶液に10,000単位のコラゲナーゼと83mgのヒアルロニダーゼを添加して酵素溶液を調製する。酵素溶液は-20℃で50μLに分注してください。

網膜組織の調製（2時間）

注：このセクションのすべての手順は、暗い赤色の照明下で実行する必要があります

1. 解剖の少なくとも1時間前に動物を暗順応させる。暗い赤色の照明下ですべての手順を実行します。
2. CO ₂窒息により動物を安楽死させ、眼球を予め酸化された細胞外溶液を含むペトリ皿に摘出する。
3. 針で角膜を突き刺し、角膜と強膜の境界にある眼科用はさみで切ることによって、角膜を切り取る。
4. レンズを使用して取り外す＃5鉗子。静かに鉗子で強膜の涙を作り、網膜と強膜が会合する視神経を切断する。慎重に網膜から強膜を除去し終える。
5. ＃5鉗子を使用して透明な硝子体を取り除く;一旦除去すると、硝子体は鉗子に付着したゼラチン状物質として現れる。網膜を半分にスライスし（4個/動物があるように）、使用するまで室温で酸素添加した細胞外溶液に保存する。
6. 記録チャンバーに組織をマウントする準備ができたら、500μLの酸素添加された細胞外溶液で希釈した酵素溶液中でインキュベートするために網膜を置く。ペトリ皿の中でシェーカー上で室温で2分間インキュベートする。
   1. 酸化された細胞外溶液中の網膜を洗浄し、組織をガラス底の記録チャンバーに入れる。組織に損傷を与えずに網膜を移動させるために先端を切り取ったプラスチック製の移送ピペットを使用してください。
7. のために使用します感光体層が下になるように組織を注意深く平らにする。ピペットを使用して余分な液体を除去する。ナイロンメッシュのプラチナリングを使用して組織を固定する。
   注：この方法は、標識されたアマクリンおよび双極細胞からRNAを単離するための組織を調製するためにも使用することができる。
8. 酸素添加された細胞外溶液でチャンバーを満たし、顕微鏡ステージにマウントします。 2〜4mL /分で酸素添加した細胞外溶液を含む組織を灌流する。

GFP +網膜神経節細胞の視覚化および標的化（10分）

注：このセクションのすべての手順は、暗い赤色の照明下で実行する必要があります

1. 開始前に、マイクロピペットプラーを用いて電気生理学的記録のためにガラスマイクロピペット（OD：1.2mm、ID：0.69mm）を引っ張る。電極には以下のプロトコルを使用してください（パラメータは必要な抵抗を達成するように調整する必要があります。引っ張り機やガラスによって異なります）：ヒート：ランプ+10;プル：0; Vel：23;遅延：1;圧力：500;プログラムループ：5回。チップの直径が約1μmであることを確認してください。大きなセルをターゲットにする場合は2〜4MΩ、小さなセルをターゲットに使用する場合は5〜7MΩの抵抗が必要です。
2. 赤外線差分干渉コントラスト（IR-DIC）光学系（ 図1A ）を用いて、神経節細胞層を観察する。 epifluorescence（〜480 nm）を用いてGFP +網膜神経節細胞（RGCs）を同定する（ 図1B ）。
3. DICの細胞内溶液で満たされたピペットを探します。わずかな正の圧力をかけて、アンプの電圧オフセットをゼロにします。
4. グラスマイクロピペットをGFP +細胞に対して押し、陰圧を適用してピペットと細胞膜との間にGΩシールを形成する。シール抵抗を監視するために、テスト電圧コマンドステップ（ 例えば、 5mV）を印加します。安定した密封を形成した後、nの短いパルスを印加することによって膜を破裂させる全細胞アクセスを得るための圧力。
5. 細胞の樹状突起が蛍光トレーサーで満たされるまで1〜2分間待つ。
   注：細胞は、エピ蛍光（ 図1C ）の形態を調べることによって、形態学的に型付けすることができる。メラノプシン発現RGCの場合、内網状層の樹状層状化は、落射蛍光下で蛍光トレーサーで満たされた樹状突起を調べ、神経節付近のオフサブレイマ（M1 ipRGCs）において体細胞から遠くに層化するかどうかを決定することによって可視化される（M2＆M4 ipRGCs）、またはその両方（M3 ipRGCs）である。この観察は、細胞サイズ（M4sは他のすべてのipRGCサブタイプと比較して明らかに大きなsomasを有する）と組み合わせて、細胞タイプ20,21,22の同定を可能にする。したがって、この技術は、RNAアイソソームの前にインビトロで細胞型の同定を可能にするLation。この方法は、樹状形態または細胞生理学のいずれかを含む他の細胞型同定プロトコールについても改変することができる。

4.細胞単離（2分間）

1. 始める前に、卓上マイクロ遠心分離機を2,000 x gに設定してください。チューブ（OD：3/32 in、ID：1/32 in）を1 ccシリンジで接続して、サンプル排出装置を準備します。
2. 氷上に10μLの溶解バッファーと1％β-メルカプトエタノールを含む0.2mLのPCRチューブを置きます。 DEPC処理H ₂ Oを含む1ccシリンジを準備して、ピペットチップをすすいでください。試料採取後、溶解緩衝液を凍結するためにドライアイスの容器を準備する。
3. 慎重に10mLシリンジを使用して負圧を適用することによって細胞ピペットの細胞質含有量を抽出する;可能であれば、オルガネラを含むすべての細胞質成分を抽出すべきである。
   1. DICの抽出をモニターするには、細胞体の大きさを縮小する。抽出後ピペットを組織から注意深く持ち上げ、溶液からピペットをすばやく取り除きます。
4. ヘッドステージホルダーからピペットをすばやく取り出し、1mLシリンジを使用してDEPC処理H ₂ Oでピペットチップをすすいでください。サンプルを排出するために、ピペットを密閉チューブを介して1 mLシリンジに接続します。
5. 直ちに、細胞を、0.2mLのPCRチューブ中の1％β-メルカプトエタノールを含有する10μLの溶解緩衝液1中に排出する。
   注：気泡を吸入しないように、細胞を吸引して全体を静かに追い出す必要があります。
   1. チューブを卓上ミニ遠心機で2,000 xgで10秒間短く遠心します。ドライアイスで直ちにサンプルを5分間フラッシュ凍結させます。凍結後、最良の結果を得るために2週間まで-80℃で保存してください。サンプルは長く続きますが、できるだけ早く処理することをお勧めします。

1. 最初に、逆さまのP20またはP200チップホルダーの上部を96ウェル磁気スタンド^23にテープで固定して磁気セパレーターデバイスをセットアップします。
2. 新鮮な70％エタノール（EtOH）を調製する - サンプルあたり約1 mLで十分です。 RNA磁気ビーズを4℃で保存し、RTで少なくとも30分間解凍する。
   注：このプロトコールの多くのステップは、効率と迅速な処理に依存しているため、一度に処理できるサンプル数は8を超えないようにしてください。
3. 磁気ビーズが室温になったら、30秒間ボルテックスして溶液がよく混合されるようにします。
   注：ビーズはRNAに選択的に結合するRNA特異的バッファーを使用し、磁気プレートスタンドで使用する場合は他の細胞廃棄物の除去が可能です。
4. RTで1分間細胞を解凍し、各サンプルに5μLのRNaseフリーH ₂ Oを加える。ピペット上下。 22μLのRNAビーズを各チューブとピペットに加えますeを徹底的に混合する。 RNAを相互作用させて磁気ビーズと結合させるために、サンプルを室温で5分間インキュベートする。
5. チューブを磁気分離装置に置き、8分間放置する。続行する前に、上清が透明であることを確認する。 1つのペレットからビーズを観察し、ピペッティング中にビーズをはがさないように注意してください。
6. 試料から上清を除去し、150μLの70％EtOHを加える。 EtOHを除去し、2回以上洗浄を繰り返す。
7. 試料を6分間空気乾燥させる。 EtOHがチューブの底に集まっているかどうかを断続的にチェックしてください。それに応じてそれを削除します。
8. サンプルが乾燥している間に、19μLの溶解バッファー2と1μLのRNase Inhibitor（40U /μL）を組み合わせて10X反応バッファーを調製します。簡単にスピンダウンして氷上に保ちます。
9. サンプルが乾燥し、ビーズペレットが光沢を示さなくなったら、磁気分離器からチューブを取り出し、9.5μLのRNaseフリーH ₂ Oサンプルを再水和する。サンプルを氷上に置き、10μlの反応緩衝液1μLを各サンプルに加える。

6.逆転写（10分）

注：開始する前に、氷上で逆転写（RT;酵素を除く）に必要な試薬を融解する。これらには、プライマーII、緩衝液1、オリゴヌクレオチド、およびRNase阻害剤が含まれる。

1. 各チューブに2μLのプライマーII（AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT _（30） N _-1 N、N _-1はA、CまたはGであり、NはA、C、GまたはT;12μMである）を加える。 72℃で3分間予熱したサーモサイクラーにチューブを入れる。
2. インキュベーション中、RTマスターミックスを調製する。各反応について、緩衝液1（250mM Tris-HCl、pH8.3; 375mM KCl;および30mM MgCl ₂ ）4μL、オリゴヌクレオチド（48μM）1μLおよびRNase阻害剤（40U / μL）。
3. インキュベーションの直後に、チューブを氷を2分間添加する。
4. 逆転写酵素（100U /μL）の反応につき2μLをマスターミックスに加え、完全にピペットに入れる。 7.5μLのマスターミックスを各チューブに添加し、穏やかにピペットで混合する。チューブを短く回転させて内容物を底に集め、以下のプログラムで予熱したサーモサイクラーに入れる：42℃で90分間、70℃で10分間、および4℃での保持。
5. 処理を行う前に-20°CO / Nでチューブを保管してください。サンプルは長時間保管する前に増幅ステップを通過することを推奨します。他の情報源は、4℃でのO / N貯蔵もまた、このステップ²⁴において許容可能であることを示唆する。

cDNA増幅（2.5時間）

注：開始する前に、PCRバッファーとPCRプライマーを氷上で解凍し、PCRマスターミックスを作成する前に、卓上ミニ遠心分離機でチューブを回転させます。

1. 各反応について、p25μLのPCRバッファー、1μLのPCRプライマー（12μM）、1μLのDNAポリメラーゼ、3μLのヌクレアーゼフリーH ₂ Oを含むPCRマスターミックスを再調製する。添加の直前にDNAポリメラーゼを最後に添加するマスターミックスをサンプルに追加します。
2. 各チューブに30μLのマスターミックスを加え、10秒間2,000 xgで回転させて、チューブの底に内容物を集める。
3. 次のプログラムで予熱したサーモサイクラーにチューブを入れます：95℃で1分間; 98℃10秒間、65℃30秒間、および68℃3分間の34サイクル; 72℃で10分間; 4℃で保持する。
   注：このPCRのサイクル数は、提案された製造元の指示とは異なり、34まで増加しました。反復試験の後、このサイクル数は一貫して信頼できる結果をもたらすことが分かった。
4. 続行する前に、チューブを-20℃で最大1年間保管してください。

増幅されたcDNの精製A（30分）

1. 精製を開始する前に、少なくとも30分間、DNAビーズおよび溶出バッファーを室温にしてください。新しい80％EtOHを調製する;サンプル1 mLで十分です。各サンプルに1μLの10X溶解バッファーを加えます。
2. DNAビーズを30秒間ボルテックスし、50μLのDNAビーズを各サンプルに添加する。ピペットで十分に混合し、次に2,000 xgで10秒間短時間スピンダウンします。チューブをRTで8分間インキュベートする。
3. チューブを磁気分離装置の上に5分間置く。静かに上清を上下に2回ピペットでかけ、サンプルを2分間放置する。サンプルが磁気デバイス上にある間に、上清を除去して廃棄する。
4. 新しく作成した80％EtOH 150μLを各サンプルに加え、RTで30秒間放置する。 EtOHを除去し、EtOH洗浄を1回繰り返す。
5. 簡単にサンプルを回転させ、磁気分離器の上に1分間置きます。残りのEtOHをすべて除去し、試料を5分間空気乾燥させる。
6. ビーズペレットがもはや光沢がなくなったが、亀裂が現れ始める前に、磁気分離器からチューブを取り出し、17μLの溶出緩衝液を加える。ビーズを完全に再懸濁するために、ゆっくりピペットで上下にピペットをかけます。
7. 再懸濁したサンプルをRTで2分間インキュベートする。
8. 簡単に試料を回転させて、液体をすべて底部に集め、磁気分離器上に2分間置く。 15 mLの透明な上清を1.5 mLのRNaseフリーチューブに移し、-20°Cで保存する。
9. 1μLのcDNAを用いて高感度バイオアナライザーチップを用いてcDNAライブラリーの品質とサイズを調べます。 cDNAライブラリーの理想的なサイズは、少なくとも10 ng /μLの濃度で0.3-2 Kbです（ 図2 ）。
   注意：サンプルをスクリーニングして、既知のマーカーの発現を確実にするためにPCRを採用することもできますeparation。

9.濃度およびタグ付けcDNAの決定（20分）

1. 開始前に、アッセイ試薬、希釈バッファー、およびスタンダードを室温に30分間置いてください。 1反応あたり1μLのアッセイ試薬と199μLの希釈バッファーを含むマスターミックスを調製する。この混合物199μLをアッセイチューブ500μLに分注する。サンプル1μLを添加し、完全に混合する。
2. アリコート190μLのマスターミックスをチューブ1＆2に加えます。10μLのスタンダード1をチューブ1に、10μLのスタンダード2をチューブ2に加える。すべてのサンプルチューブと標準チューブを5秒間ボルテックスする。 RTで3分間インキュベートする。
3. 高感度蛍光光度計でサンプルの濃度を測定する。 "calculate stock solution"オプションを選択し、 "1μL"を強調表示して、正しいサンプル量が入力されていることを確認します。 RNaseフリーのH ₂ O中で各サンプルを別の1.5mLチューブで0.2ng /μLの最終濃度に希釈する。
   注意：製造者の指示書によれば、1ng /μLのDNA総量で開始すべきであることが示唆されているが、我々はより少ない開始量を使用し、この改正を説明するためにプロトコールを調整した。
4. 新しい0.2 mLのPCRチューブで、2.5μLのバッファーをピペットで加えます。2. 1.25μLのcDNAを適切なチューブに加えて合計250 pgとします。最後に、各チューブとピペットに1.25μLのタグ付けミックスを加えて混合します。タグ付け混合物中のトランスポザーゼは、DNAを短鎖に断片化し、後でシーケンシング装置によって使用するために、各鎖のいずれかの末端にアダプターをアニールする。
   注記：タグ付けおよびインデックス結合に使用される体積は、製造元の指示に従って推奨される量の一部です。これは試薬の保存を可能にするだけでなく、我々の経験で一貫して標識されたサンプルを生成した。
5. チューブを1分間カウンターマイクロ遠心機で遠心分離する。
6. チューブを置く以下のプログラムを用いて予熱したサーモサイクラー中でインキュベートする：55℃で10分間および10℃での保持。
   注：このインキュベーションの長さは、製造業者の指示書から提案された5分とは対照的に、10分である。
7. このプログラムが完了した直後に、チューブを取り出し、1.25μLの標識化中和緩衝液をそれぞれに加える。ピペットで混合し、室温で5分間インキュベートする。この段階を速やかに完了します。これは、バッファーが酵素を中和して反応を停止するまで、トランスポザーゼが活性状態のままであるためです。

インデックス結合および精製（1時間）

注：DNAビーズと再懸濁バッファーを始めて30分間以上RTに戻してください。各サンプルにどのインデックスを使用するかを決めます。

注：これらのインデックスは、シーケンシング後のサンプルの同定のために断片化されたDNAのそれぞれの5 'および3'末端に結合される。 2つのペアリングは、一緒に配列することができるサンプルについて同じである。たとえば、サンプル1がインデックスwhite 1とオレンジ1を使用する場合、サンプル2はホワイト1とオレンジ2、またはホワイト2とオレンジ2を使用する必要がありますが、決して同じインデックスの組み合わせは使用しないでください。このキットには、4種類の白色と6種類の異なるオレンジ色のインデックスが含まれています。異なる可能な組み合わせのすべてが、1つのシーケンシングレーンに最大24のサンプルをプールすることを可能にする。我々は通常、レーンに10サンプルしかプールしませんが、24指標を含むキットを使用することもできます（必要に応じて、1レーンのシーケンシングで96サンプルをプールすることができます）。

1. 各チューブに、その特定のサンプルのための1.25μLの左のインデックスおよび1.25μLの右のインデックスを加える。 3.75μLのPCRマスターミックスを添加し、よく混合して混合する。
2. カウンターマイクロ遠心機で1分間遠心分離する。
3. 次のプログラムで予熱したサーモサイクラーにチューブを入れる：72℃で3分間; 95℃で30秒; 95の12サイクル76℃、10秒間、50℃で30秒間、および72℃で1分間; 72℃で5分間; 4℃で保持する。
   注：最初の95℃ステップは98℃から変更されました。これは製造元の指示に従っています。また、サンプルの最適なタグ付けを可能にする温度と時間の長さになるようにサイクルの詳細を調整しました。最後の72℃のインキュベーションもまた我々のプロトコールに加えられ、製造者の指示書には含まれていなかった。
4. チューブを簡単に回転させて、内容物を底部に集める。 30秒間DNAビーズをボルテックスし、各チューブに30μLを加え、ピペットで完全に混合します。
5. サンプルを室温で5分間インキュベートする。
6. サンプルを磁気分離器の上に2分間置く。上清を2回上下にピペットし、1分間サンプルをインキュベートする。
7. 透明な上清を除去して捨てる。各サンプルに150μLの80％EtOHを加えて除去する。 EtOH洗浄を1回繰り返します。
8. 許可するサンプルを10分間空気乾燥させる。間欠的にチェックして、EtOHがチューブの底に集まっているかどうかを確認し、必要に応じて取り除きます。
9. DNAビーズペレットに亀裂が現れ始めたら、磁気分離器からサンプルを取り出し、27.5μLの再懸濁バッファーを加えてペレットを再水和させます。ペレットが完全に再懸濁されていることを確認し、RTで2分間インキュベートする。
   注：再懸濁バッファーに使用される容量は、プロトコールでの出発物質の量がより少なくなるように変更され、製造元の説明書の推奨量とは異なります。
10. チューブを磁気分離器の上に2分間置いてください。透明な上清25μLをRNaseフリーチューブに移し、-20℃で保存する。
    注：ライブラリの正規化を完了するには、メーカーの指示に従わないでください。サンプルは、このステップに続いてうまく調製され、そのまま配列決定のために調製される。
11. tを分析するバイオアナライザチップおよび各サンプル1μLを使用して、サンプルを攪拌する。
    注：塗抹標本の分析は先に実施される。しかし、cDNAは0.2-1 Kbのサイズ範囲で検出されるはずである（ 図3 ）。この点以下のスミアはサンプルの分解を表し、スミアが大きいほどタグ付けが不完全であることを示唆する。

11.サンプルのプール（10分）

1. 高感度蛍光光度計を用いて、タグ付け試料の濃度をより早く取得し、濃度をnMで測定する。
   注：この計算は、インターネット変換ツールを使用して計算することができ、バイオアナライザートレースからの平均フラグメント長に依存します。平均フラグメント長を決定するために、各サンプルのトレースを個別に観察し、平均DNAフラグメントのサイズを決定する。これは、スミアの範囲を強調して、バイオアナライザートレースを調べるときにも計算することができるプログラムによって計算されたモル濃度。
2. プールに各サンプルの同じ濃度が含まれるようにサンプルを組み合わせる。サンプルを希釈しないでください。プールは最低濃度のサンプルと同程度に希釈されていなければならず、理想的には少なくとも15nMの総濃度を有するであろう。
3. シーケンシングの前に、プールされたサンプルを-20℃で保存する。サンプルはプールの1週間以内に配列決定を受けることが示唆されている。 HiSeqプラットフォームとのペアエンド、100 bpシーケンシングを実行します。

細胞タイプは、色素注入後に容易に分類される

図1は、蛍光トレーサ充填の前後のGFP + RGCの例を示す。この細胞は、トランスジェニック系統におけるGFPの発現に基づいて同定された（ 図1A ）。この細胞の細胞体上に細い先端の引っ張りガラス電極を用いて密封した。サブタイプを特徴付けるために、蛍光色素を体細胞に注入し、全ての関連するプロセスを満たすことができた（ 図1B ）。 M4 ipRGCの分類は、この細胞が非常に大きな細胞を有し、そのプロセスが内網状層のONサブレイミナ内で終了するという観察によって可能になった（ 図1C ）。孤立した網膜標本で識別できる層別の違いの例として、M1（OFF-stratifying）、M3（Bistratified）およびM4（ON-stratifying）ipRGCを蛍光トレーサーで固定し、ONおよびOFFサブラミナ（ 図1D ）の共焦点画像化を行った。共焦点イメージングによる樹状突起のこの視覚化は、細胞が蛍光トレーサー（Schmidt and Kofuji 2009、2010、and 2011）で満たされたときに、未固定インビトロ組織において樹状突起がどのように見えるかと非常に類似している。

単一細胞からのcDNAライブラリー

Oligo d（T）プライマーの使用は、mRNAの選択的逆転写および増幅を可能にする。各細胞からcDNAライブラリーを生成および増幅した後、バイオアナライザーチップを使用して、ライブラリーの品質およびサイズを評価した。この分析の結果は、理想的なcDNAスメアが、良好なサンプルにおいて0.5〜2Kbであることを示している（ 図2A ）。いくつかのサンプルは、300 bp以下の数のバンドまたはスミアを示します。sugこれらのライブラリの品質が悪いと考えています（トラブルシューティングについては表1を参照）。良質のバイオアナライザのトレースの例は、300bp以下のDNAバンドをほとんどまたは全く示さず、500bp〜2Kbの間の強い汚れを示す（図2B）。空のコントロールレーンは、35＆10380 bpの下限マーカーと上限マーカーを表示し、安定したベースラインは変動しません。優れた読み取り深度と高いマッピング率を実現した図2Bと図2Cの両方で見ることができるように、様々なライブラリが品質データを生成することができます。予想されるサイズの強力なcDNAライブラリーを持つサンプルのみをタグ付けする必要があります（トラブルシューティングについては表1を参照）。

低入力のタグ付けは、高品質のサンプルをシーケンシング用に準備します。

このプロトコールは、少量の出発材料を用いてタグ付けに最適化されている l。より少ない量が適切に増幅されず、より多くの量が完全に断片化しないので、成功したタグ付けのためには250pgだけが最適である。タグ付けおよびPCR増幅/サンプルクリーンアップを完了した後、サンプルを再びバイオアナライザーチップで分析した。この時点での理想的なcDNAスメアは、0.2-1Kbであるべきである（ 図3A ）。トレースは、これらの2つのサイズ（ 図3B ）の間で滑らかで均等に見えるはずです。このトレースはレーン1のサンプルに対応する。 図3Cは不完全なタグ付けを示し、容易に解決することができる（トラブルシューティングのために表1参照）。私たちはサンプルについてデータ解析を行い、このプロトコルが優れた読み取り深度を持つサンプルを作り出したことを発見しました。 69.1％のマッピングの平均; 5,000を超える遺伝子を発現する。

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図1：メラノプシンを発現するipRGCsおよび形態学的性質におけるGFP発現に基づくRGCs型の同定。 （ A ）網膜の神経節細胞層。全マウント網膜調製物においてIR-DICを用いて視覚化された。 （ B ） GFPを発現する神経節細胞を同定するために、同じ調製物を落射蛍光（〜480nm）で視覚化した。 （ C ）パッチクランプ記録を目的とし、蛍光トレーサーで満たされたGFP発現細胞。この細胞は、その非常に大きな細胞サイズおよびON層化樹状突起25,26に基づいて、M4 ipRGCとして同定することができる。 （ D ）IPL（M1）のONおよび/またはOFFサブブラミナ、IPL（M4）のONサブレイミナ、ならびにIPL（M3）のONおよびOFFサブラミナの両方において撮像されたipRGC樹状突起の共焦点画像。 IR-DIC：赤外線微分干渉コントラスト。.jove.com / files / ftp_upload / 55229 / 55229fig1large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2：バイオアナライザトレースを用いたcDNAライブラリー品質の分析。 （ A）逆転写、増幅および精製された複数のサンプルのバイオアナライザー出力例。レーン1〜3は理想的なDNAスミアを示し、大部分のDNAは300bpより大きい。この範囲の塗抹標本を有するライブラリーは、一貫して優れた配列決定データを提供し、細胞当たり平均5,683の遺伝子発現を示した。レーン4は、うまく処理されず、したがってcDNAを産生しなかったサンプルを表す。成功したコントロールレーンは、35および10,380 bpで一定のベースラインと2つのきれいなピークを持っています。 （ B ）2Kb前後の高強度のcDNAを用いたバイオアナライザーの成功例。これは （ C ）500bp付近のcDNAを用いたバイオアナライザートレースの成功例。このトレースは、レーン3のサンプルに対応しています。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3：タグ付けされたサンプル0.2〜2Kbの間のロバストなスミアを示します。 （ A ）タグ付け、増幅およびPCRクリーンアップ後の代表的なバイオアナライザ出力。 （ B ）（A）のレーン1に対応する正常に標識された試料のトレース。 （ C ）約1Kbのピーク強度でクリアされた、不完全なタグ付けを有するサンプルのトレースの例。">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

表1：議定書における潜在的な障害の解決策と提案。この表には、このプロトコル中に起こり得る潜在的な困難と、それらが遭遇する可能性のある手順が記載されています。この表には、これらの問題の多くに考えられる原因と、問題を解決するのに役立つ解決策が記載されています。

著者は何も開示することはない。