ネッタイシマカジカのベクトルで脂肪ボディ臓器培養システム

蚊は、マラリア、デング熱、チクングニア、ジカ^1,2,3などの壊滅的な人間の病気のベクトルであります。これらの疾患を抑制するためと病気送信蚊の個体数を制御する強烈な国際努力にもかかわらず蚊媒介疾患の流行の発生がまだ一般的、とりわけ途上国における。多くのこれらの病気に対する効果的なワクチンが利用できなくまたは限られた有効性^4、5の。感染を防ぐ最も効果的な方法は、殺虫剤トリートメントを使用して主に、蚊の個体数を制御することです。ただし、殺虫剤抵抗性蚊個体群の多くで開発し、世界^6,7,8のまわりの共通の問題になります。蚊の生理学の研究は、新規ツールおよび病気を制御するための戦略の開発に不可欠です。

蚊の脂肪体は、栄養貯蔵、代謝恒常性、複製、および異物の異化^9,10、11,12で中心的な役割を果たしています。それはトリグリセリド、グリコーゲン貯蔵タンパク質の中のアミノ酸の主なストレージ臓器です。それはまたほとんどの体液蛋白質および代謝産物の合成の場所として機能します。蚊の脂肪体は女性で彼らは血食事^13,14を取る後に発生卵黄蛋白質の生産の唯一のソースです。

脂肪体の主たる細胞型、大型、倍数体の trophocyte または脂肪^3,9,10,12です。脂肪体組織は葉や葉鞘に編成し、脂肪体の大きな葉が腹部の体壁に接続されている、腹部に位置する最大の部分と、蚊のすべての体の部分で見つけることができます。

ここで示した蚊脂肪体文化システムを 70 年代に開発し、脂肪体生理学¹⁰、特に現在の解析技術との組み合わせを研究するための強力なツールのまま。この手法の基礎は、腹部の体壁と関連付けられた脂肪体組織の分離に基づいています。腹部のキューティクルの疎水性と、没頭して腹部の脂肪体の添付の葉と培養液の表面に浮くされます。培養組織の酸素化の確保、気門および tracheolar 構造が保持されます。今後、我々 がこれらの準備を「脂肪体」として参照してください。分離脂肪体 (未発表結果) 適切な培地で培養したときに 12 時間以上実行可能に残る。脂肪体の文化はさまざまな脂肪体内分泌生理学^{9,10,12,15,16、に関する質問を対処している貴重なツール 17}。

培養脂肪体は様々 な実験的に受けることができ、治療のタイミングは、決定は、捜査官を制御します。脂肪体の収集し、qPCR^16,17,18,19, ウエスタンブロット^{18 を含む下流の解析処理潜伏期間の終わりに、、20}、プロテオミクス²¹、またはメタボロミクス²²。実験は、一緒に培養することができます何百ものグループに個々 の脂肪体から、さまざまなスケールで実行できます。

ここに含まれる代表的な結果は、アミノ酸および濾胞^{16,17、血液の食事活性化をシミュレートするためにステロイド ホルモン 20-ヒドロキシ脱皮ホルモンの存在下で培養した脂肪体から派生しました。 23,24}。私たちは分析し、次世代シーケンス解析を介して活性化脂肪体対ないアクティブの差動遺伝子発現を比較しました。

1 ですソリューションと試薬の準備

1. アミノ酸原液
   1. 準備 4 X アミノ酸原液 ^{23 , 24} の重さによって、。表 1 の濃度によると三角フラスコに 20 種類のアミノ酸を追加します
      。 注: いくつかのケースで amino acid(s) ソリューションから除外でき等しい浸透圧物質濃度を維持するためにマンニトールのモル同量に置き換えられます
   。
   2. DdH ₂ O ソリューションの適切なボリュームを生成するための適切な量を追加します
   。 アミノ酸が完全に溶解していることは、確実に
   3. 熱液体が完全にクリアされるまで継続的に攪拌しながら優しく; わずかな黄色の色合いにかかります
      。 注: 解散するより疎水性アミノ酸のいくつかを許可するように塩酸を追加することによって pH を 6 に削減が必要になる場合があります
   。
   4. ソリューションの約数と滅菌フィルター シリンジ フィルターを用いた 0.2 μ m 孔サイズ
   。
   5. -20 ° C まで 6 ヶ月間で密封された容器でストア
   。
2. AP
   注: ²⁵ を参照してください。
   1. 20 X の原液を塩、水 50 mL で 表 2 に示す塩を組み合わせます。完全に溶解するまで攪拌します
      。 注: 少し熱塩を完全に解消するソリューションが必要になる場合があります
   。
   2. 無菌フィルター シリンジ フィルターを用いた 0.2 μ m 孔サイズと-20 で 50 mL のチューブで、ソリューションを格納 ° C
3. カルシウム原液
   1. カルシウム原液 X 50、100 mL の水 (表 3) に塩化カルシウムの 0.90 g を追加; 完全に溶解するまで攪拌します
   。
   2. 注射器を用いた無菌フィルター 50 mL チューブに分注 0.2 μ m の細孔径を持つソリューションをフィルターや-20 デパート ° C
4. Tris バッファー (pH 7.4)
   1. 、トリス バッファー、塩と 表 4 のソリューションを組み合わせて、ddH ₂ O を追加 100 mL.
   2. 注射器を用いた無菌フィルター フィルター 0.2 μ m の気孔のサイズそして因数のソリューション 50 mL チューブに; 常温で保存します
   。
5. 脂肪体培
   1. 脂肪体の培養培地を準備する上記のすべてのソリューションを準備します
   。
   2. 表 5 脂肪体培地 200 mL にボリュームに従ってそれらを結合します
   。
   3. 7.2 水酸化ナトリウムや塩酸を使用して pH を調整します
   。
   4. 無菌フィルター シリンジ フィルターを用いた 0.2 μ m 孔サイズ ソリューションです
   。
   5. 15 ml にソリューションを分割し、-20 ° C で 6 ヶ月保存します
   。

2。郭清の準備

1. 照明顕微鏡 (10-20 倍の倍率) を準備し、2 つの極細ピンセットと顕微解剖はさみのペアを置く
。
2. は、実験に必要なすべてのソリューションを準備します。部屋の温度に脂肪体培養液を解凍
   。 注: 沈殿は優しくない 30 以上にソリューションを加熱することによって解散することができます ° C
3. ヒメアリ、雌成虫蚊 (出現後 3-7 日) を収集し、それらの麻酔二酸化炭素または氷を使用して
   注: 一度麻酔、蚊べき CO ₂ の下で最短の時間で可能であれば、代わりに 20 分を超えない、蚊が氷の上に麻酔され約 30 分の
4. 3 ml の APS の井戸あたり 6 ウェル プレートを準備します
。

3。脂肪体解剖

1. 解剖顕微鏡の焦点を当てるし、快適な高さに椅子を合わせる
。
2. 顕微鏡表面に凹顕微鏡スライドを配置し、中心に AP の 2 滴を追加します
。
3. 、鉗子を使用して足を蚊をピックアップし、顕微鏡スライドの APS の表面にそれを転送します
。
4. 慎重に左の手でピンセットで胸郭によって蚊をグリップし、腹側、上向きに蚊を回転します
。
5. 胸郭によって安定した体を保持している間、右手の鉗子で最後の 2 つの腹部のセグメントをつかみ、注意深く引き出します
   。 注: 最後の 2 つの腹部のセグメント腹部からと添付の卵巣、キイロショウジョウバエマルピギー細管、後腸、中腸; 分離されます。時々、作物は、腹部からスライドされます。彼らが削除されていない場合作成された小さな穴に鉗子の閉鎖のヒントを挿入し、残りの組織を削除します
。
6. は、右の鉗子を脇、春はさみを拾います。胸部下のセグメントまでの腹部の穴に 1 つのブレードをスライドさせます。優しくかつ腹部に縦にカットします
   。 注: カットがなされたら、腹部だすべき外側に展開、これはすぐに発生可能性があります
。
7. 横カットは、胸郭の下や最初のカットが終了した位置より少し下になります 2 番目のカットをすることを続行します
   。 注: 腹部必要があります開くし、キューティクルと AP 内側浸漬脂肪体、胸部から切り離して考えます。、この腹部の体壁は 生体外で 文化のための脂肪体準備します
。
8. は組の鉗子の先端を使用して、APS ソリューションから脂肪体を持ち上げ、ソリューションから室温で AP を含む 6 ウェル プレートに転送。脂肪体文化に進む前に約 0.5 時間の残りの部分にティッシュを許可します
。

4。脂肪体文化

1. それらを平衡に少なくとも 0.5 h の室温での AP の脂肪体をインキュベートします
。
2. は、鉗子の先端を使用して脂肪体を転送し、優しくそれらを APS ソリューション持ち上げます。脂肪体培地に先端を下げる
   。 注: 脂肪体に媒体の表面上を開き、自由に浮かぶ。脂肪体の文化は、通常、各ウェル中の 150-200 μ L での 96 ウェル プレートで行います。1 つも、3 つまでの個々 の脂肪体を合うことができるし、彼らが 12 時間以上 (未発表の個人的な結果) の実行が可能です
。
3. 潜伏期間後脂肪体を培地からダウン ストリーム処理のための適切な試薬を含む 1.5 mL 遠心チューブに転送します
   。 注: 典型的な分析を含む qPCR ^{16 , 17 , 18 , 19}, ウエスタンブロット ^{18 ,}メタボロミクス ^{22 21}、プロテオミクスやトランスクリプトミクス ^{26 20}
。

例として脂肪体培養実験を行いすべて 20 自然発生するアミノ酸と 6 h の昆虫ステロイド ホルモン 20-ヒドロキシ エクジソン (10 μ M) の釣り合った混合物が含まれているソリューションにそれらをインキュベートし分離脂肪体を刺激.コントロールとして時間の同量のための AP の脂肪体が孵化します。

インキュベーション後、総 RNA は、製造元の指示に従って三試薬27を使用して分離された.抽出した RNA サンプルの量と質は、分光光度計、蛍光定量と agarose のゲルの電気泳動を使用して評価されました。RNA シーケンス ライブラリの総 RNA の 4 μ g を使用して生成された、2 つの異なる手法を使用して定量を行った。その後、ライブラリは、ペアの終了シーケンスの商用プロバイダーに送られました。

この実験の結果は、表 6のとおりです。アミノ酸と 20-ヒドロキシエクジソン最強の転写応答を示す遺伝子は、主に卵黄のタンパク質の遺伝子、前の結果11に一致していた。

図 1は、差動 1,256 の遺伝子発現レベルを示すヒートマップ 2 つの異なる治療後の培養脂肪体からの遺伝子の表現を示しています。

図 1.脂肪体培養で発現する遺伝子のヒートマップ。ヒート マップは各遺伝子 R ソフトウェア環境の一部であるヒートマップ パッケージ28を使用して異なるライブラリ内の特定のコピーの数に基づいて計算されます。暗い影は、高い発現を表します。式の統計的に有意な変動を持つ 1,256 遺伝子 (Q 値 < 0.05) が表示されます。遺伝子は (彼らの系統関係) に従っていない左側の樹形図で示されている彼らの平均発現量に基づいて並べられています。高アミノ酸 (AA) と 20-ヒドロキシエクジソン (20 e) 刺激後のアップまたはダウン調整式と遺伝子数に注意してください。AP =ヒトスジシマカ生理食塩水。遺伝子との相対発現量のリストについて補足のファイル 1を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1。アミノ酸原液 x 4。

表 2.20 X 塩原液。

g > テーブル 3。カルシウム原液 x 50 。

表 4.トリスバッファー 。

表 5 。脂肪体培。

表 6.実験結果。

補足ファイル 1.このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

何を開示する必要があります。