ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

その環境と成長を調整するために、植物は感覚、変換、およびシグナリングのキューに対応するエレガントなシグナル伝達経路を進化してきました。リレー競技で走者のような蛋白質、植物シグナル伝達に必要な選手です。タンパク質間相互作用 (PPI) が携帯電話通信のための主要な役割を果たしていること広く認識されています。蛋白質のリン酸化、アセチル化、劣化がすべてターゲット蛋白質とその変更の酵素間の物理的な相互作用に依存しています。たとえば、ジャスモン酸 ZIM ドメイン蛋白質 (JAZ) ファミリーのタンパク質は転写因子 MYC2 との対話、その転写活性^1,2を抑制します。PPI の重要性を与えられた植物の interactomes がされている大規模なタンパク質検討最近^3,4,5です。さらにこれらインタラクトームの結果では、多様な細胞機能を調整する複雑な規制のネットワークを明らかにします。

PPI を監視するためいくつかの確立された方法があります。イースト 2 ハイブリッド (Y2H) 試金は、PPI 検出のため最も広く使用されている方法です。Y2H は、蛋白質の相互作用を調べる簡単なテストに適して行うには、簡単です。Y2H も広く、特定興味の蛋白質のための未知の相互作用パートナーをスクリーニングに使用されます。ただし、Y2H が酵母で実施して完全ので植物の本当のシナリオ細胞し、高い偽陽性率をもたらす反映できません。別の似たような戦略は、プルダウン試金です。一般に、2 つのタンパク質が表明したエシェリヒア属大腸菌のセルから浄化し混合し、蛋白質の相互作用を検出するため固定化します。この方法は時間がかかるが、それを取得できません体内の相互作用の結果か。生体内での相互作用目的のため co-免疫沈降 (co IP) は、最も人気のある試金、高品質 immunoprecipitate 興味の蛋白質に抗体を必要とし、間接 PPIs の可能性を除外することはできません。また、co IP で複雑な実験手順、結果通常の専門性と異なります。

記者による再構成の試金は大きく体内PPI の検出を進めます。蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)⁶、二分子の蛍光補完 (BiFC)⁷、イメージング (LCI) 試金⁸ホタル ルシフェラーゼ補完などの方法。これら 3 つのアプローチが co IP より生体内で直接反映するように PPI、フレット、BiFC 蛍光信号を検出する特定の顕微鏡を必要し、簡単に相互作用強度を定量化することはできません。対照的に、ライオンズ クラブ国際協会はその基質ルシフェリンと反応後光るホタルのルシフェラーゼの活用します。もっと重大に、ルシフェラーゼ活性値から PPI の強さを決定できます。したがって、ライオンズ クラブ国際協会だけではなく 2 つのタンパク質やないとの対話が治療の相互作用ダイナミクスに関する情報も提供するかどうかを示します。¹⁰,^,の相互作用ダイナミクス (表面プラズモン共鳴または熱安定性変化に基づく)⁹を監視するためのいくつかの確立された方法がありますがこれらのアプローチは、繊細な楽器や特殊にラベリングを必要があります。対照的に、ライオンズ クラブ国際協会は、検出を行いやすくなっています。

ライオンズ クラブ国際協会のための原則 (N = リュックまたは C = リュックをそれぞれ命名) ルシフェラーゼのアミノ末端とカルボキシル末端の半分は、タンパク質 A と B、およびタンパク質が植物細胞に表現された同時にこれら 2 つの融合と融合しました。タンパク質 A とタンパク質 B やり取り場合、は、アクティブなルシフェラーゼ酵素をルシフェラーゼの 2 つの半分が再構成されるでしょう。ルミノまたは CCD カメラでルシフェラーゼ活性を検出できます。ライオンズ クラブ国際協会; の安定した形質転換体を取得する必要はありません。一過性発現は高品質の相互作用の結果を取得するのに十分です。

リング型 E3 ユビキチン リガーゼ構成 photomorphogenic 1 (COP1) はトランスクリプション要因の無数を操作し、26 s プロテアソーム¹¹を通して彼らの劣化を促進します。これらの COP1 をターゲットとした転写因子のいくつかは、光形態形成過程の正の監督は。暗闇の中、COP1 フィトクロム COP1 E3 活動⁸を高める A-105 1 (SPA1) の抑制と対話します。光の知覚後、視細胞は COP1 活性を阻害し、安定 COP1 基板^12,13,14COP1 SPA1 相互作用を反故します。この例では、PPI を勉強し、PPI ダイナミクスの決定の生物学的意義を示しています。

1. 植物 (8 週間) の準備

1. 50ベンサミアーナ タバコ種子を 1 mL 5 %naclo と、0.1% トリトン X-100 (V/V) ソリューションおよび種子を殺菌する 5 分を残すを含む 1 つの 1.5 mL 遠心チューブに入れてください。
2. リンスの種子滅菌水を 5 回と 200 μ L の滅菌水に種子を中断します。
3. 慎重に場所個々 の種 MS 寒天培地 (1 l: (KOH) 培地・培塩 10 g スクロース, pH 5.8 × 1 1% 寒天) 罰金のヒントと発芽を同期する 3 日間の 4 ° C で店中板の表面上に。
   注: 微生物汚染を避けるためには、クリーン ベンチでこの手順を実行します。滅菌中がチューブを振るする必要はありません。
4. 10 日間の正常な成長条件 (22 ° C、80-90 µmolm^-2の^-1白い光強度) の下で中板を置き、土に発芽苗を転送します。
   注: は土に苗の根を挿入することを確認し、根に損傷を与えない。透明なプラスチックのカバーで一晩湿度を維持するためにトレイをカバーします。
5. 16/8 h/明暗サイクルと 70% 湿度制御成長部屋の植物を育てます。7 週齢(名) 形質転換植物Agrobacteriumtumefaciens浸潤 (図 1A) の準備ができています。
   注: 水の植物、植物を健康に保つために必要に応じて、害虫を制御します。

2. (名) ベンサミアーナ葉 (7-10 日) 一過性発現

1. プラスミドの提供 150 ng (pEGAD HA リュック制御プラスミド、空のベクトル、およびライオンズ クラブ国際協会の構築されたプラスミドを試金、プラスミド構築の pCAMBIA1300 Nluc と pCAMBIA1300 Cluc を使用私たちこの場合) A. 根頭がんしゅ病菌の有能なセルにひずみと GV3101、標準的なエレクトロポレーション法。
2. 文化A. 根頭がんしゅ病菌ルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天培地 (1 l: 10 g 食塩 5 g 酵母エキス 10 g トリプトン寒天培地 1.5%) 含む 50 μ G/ml カナマイシンのと 4 日間の 28 ° c リファンピシンの 50 μ g/mL。
   注: 抗生物質の選択は、ベクターと使用A. 根頭がんしゅ病菌系統に依存します。
3. 1 つを接種してカナマイシンの 50 μ g/mL および 50 μ G/ml のリファンピシンを含む LB 液体培地 3 mL に各板からのA. 根頭がんしゅ病菌のコロニーを単一細胞培養を反映する 24 h 28 ° C で 220 回転で振る。
4. 15 ミリリットル新鮮な LB 液体培地カナマイシンの 50 μ g/mL および 50 μ G/ml のリファンピシン、200 倍希釈を含むに細菌文化 75 μ L を転送します。外径₆₀₀ 0.5 〜 1.0 の間まで約 8 時間、30 ° C で 220 rpm で細菌の文化.
5. 15 mL 遠沈管にA. 根頭がんしゅ病菌液体培養を転送、4,000 x g で 4 ° C、15 分破棄上清を遠心し、ペレットを洗浄する変換ソリューションの 15 mL にペレットを中断します。
6. 4,000 x g で 4 ° C、15 分管を回転し、上澄みを廃棄します。洗浄工程をもう一度繰り返します。
7. 変換ソリューション 5 mL にペレットを再懸濁します、室温で 2 時間維持します。外径₆₀₀の最終濃度が 0.5、またはテスト対蛋白質の相互作用のための等しいボリュームとミックスの 2 つのサンプルになるまで変換ソリューションとA. 根頭がんしゅ病菌ペレットの密度を調整します。
8. 1 mL の無針注射器 (図 1B C) 7^回葉に 4^番目に浮遊細胞を浸透します。後、黒いプラスチックのカバーで植物をすぐにカバーし、12 時間暗闇の中でトレイを配置します。その後、リュックの活動を検出する前に 2 〜 4 日のいつものように植物を育てます。
   注: は、同じようなサイズの健康的な葉を選択します。1 つの葉に 4 つの異なるゾーンの浸透は良いです。

3. 検出ルシフェラーゼ活性 (1 日)

注意: ルシフェラーゼの活動を監視する 2 つの方法があります。1 つは、イメージングに基づいており、他ルシフェラーゼ活性を定量的に測定することです。

1. イメージング法
   1. 浸透した葉を外し、MS 寒天培地に全体のチラシを置きます。
   2. 葉の向軸面にルシフェリン作業バッファーを 50 mL スプレー ボトルとスプレーします。クロロフィルの自家蛍光を癒やすための 5 分間暗闇の中で材料を維持します。
   3. 低光の冷却 CCD 画像 (図 2) をキャプチャする装置 (-30 ° C に冷却) をイメージングを使用します。ライト下に露光時間は 50 ms と発光検出時間は 1 分。
      注: は、機械のマニュアルによるとパラメーターを調整します。低温はイメージの質を改善する信号対雑音比を向上させます。
2. また、商業ルミノで直接発光を測定します。
   1. 慎重に(名) ベンサミアーナ葉の浸透面積から (約 0.25 cm²) 葉片をカット、白 96 ウェル プレート (図 3) で脱イオン水の 100 μ L にリーフ ディスクを浸します。
   2. ルシフェリン作業バッファーの 10 μ L を追加し、5 分のまま。タンパク質の相互作用ダイナミクスを研究するための特定の治療法を行います。
      メモ: は、特定の治療下でのタンパク質間相互作用の動力学を表すルシフェラーゼ活性ダイナミクスを取得する異なる時点でルミノで発光を検出します。このメソッドには、同時に大量のタンパク質の組み合わせをテストするための利点があります。これらの商業ルミノなし、西部のしみによってルシフェラーゼ タンパク質組成を調べる、したがってリュック活動曲率を参照してください。光が必ずしも必要でない場合は、プレートを留めて、ルミノして異なる時点で発光を測定します。それ以外の場合、検出のギャップの中に成長の部屋にプレートを移動します。統計的に有意な結果を得るためには、少なくとも 3 つの生物学的複製を使用します。異なる浸潤ゾーンからリュック活動が異なりますが、その変化のパターンは正規化後一致しています。

3 つの主要なステップは蛋白質蛋白質の相互作用生体内で植物の成長、タバコ浸潤、およびルシフェラーゼ アッセイを含む留学このルシフェラーゼ補完プロトコルで白羽できます。このプロトコルの最も重要なステップは、 (名) ベンサミアーナ葉 (図 1) に液体A. 根頭がんしゅ病菌を浸透させています。

ジャスモン酸 COP1 SPA1 相互作用を減らすことを確認この方法の有用性の例です。COP1 と融合したルシフェラーゼのアミノ末端とカルボキシル末端の半分 (COP1-NLuc) または SPA1 (CLuc SPA1)、それぞれ。COP1 SPA1 相互作用の機能的なルシフェラーゼの相補性の結果します。(図 2)、CCD カメラによるイメージを作成したルシフェラーゼ活性とルミノ (図 3) の酵素活性を検出できます。自体、ルシフェラーゼの可能性を除外する処理による影響は、フルレングス ルシフェラーゼ (リュック) 遺伝子はまた、一時的コントロールとして機能する(名) ベンサミアーナ葉で表されます。ジャスモン酸治療 (時間 0) 前にルシフェラーゼ アクティビティが 1 として設定され、ジャスモン酸治療下で得られた各ルシフェラーゼ活性値だった正規化時間相対ルシフェラーゼ活性 (図 4) を取得する場合は 0。結果は、COP1 SPA1 相互作用 (ルシフェラーゼ活性によって反映される) 徐々 に減少、暗闇の中でことを示した、JA 治療はさらにその相互作用を低減します。

図 1.(名) ベンサミアーナ浸透のプロセス。
(A) Abaxial および浸潤の前に植物の向軸ビュー。(B)浸潤プロトコルを表示する代表的なイメージ。(C) Abaxial と浸潤後の植物の向軸ビュー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2.CCD カメラでルシフェラーゼ活性をイメージングします。
(A)通常光線の下で(名) ベンサミアーナ一葉の代表的なイメージ。(B)検出発光信号 CCD カメラ ルシフェラーゼの活動を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3。からの発光を測定する方法を示す代表的なイメージ カット リーフ ディスク。 
浸透したリーフ ディスクはカットされ、発光信号測定に白 96 ウェル プレートに入れ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4.1 過渡 luciferase 否定回路試金から代表を結果します。
(A)治療期間 (時間) と発光値 (LUC 活性) の元の結果が表示されます。各サンプルの 3 つの独立した複製があります。このグラフを準備するため別の治療時点で LUC 活性が相対的なリュック活動として時間 0 正規化。
(B)暗闇の中で徐々 に COP1 SPA1 相互作用を示す相対リュック活動の定量化が減少して、JA、さらに処理を減らすことができます。エラーバーは標準偏差 (sd) を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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