本稿では、ルシフェラーゼ活性の測定に基づく蛋白質蛋白質の相互作用を決定するための簡単かつ迅速な実験手順について説明します。
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方法論記事
ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
蛋白質蛋白質の相互作用が最も細胞プロセスのシグナル伝達を中継するための基本的なメカニズムしたがって、新規タンパク質間相互作用のペアとタンパク質の相互作用ダイナミクスを監視の同定植物が環境要因および/または発達の信号に応答する方法を明らかにするため特に重要です。アプローチの茄多は、生体外でまたは生体内で蛋白質蛋白質の相互作用を調べるために開発されています。中でも、イメージング (LCI) 最近設立されたルシフェラーゼ補完アッセイは、体内のタンパク質-タンパク質相互作用を示すため最も簡単で最速の方法です。この分析では、蛋白質または蛋白質 B は、ルシフェラーゼのアミノ末端あるいはカルボキシ末端の半分と融合それぞれ。タンパク質 A とタンパク質 B やり取り、ルシフェラーゼの 2 つの半分が機能とアクティブなルシフェラーゼ酵素を形成する再構成されるでしょう。ルシフェラーゼ活性はルミノまたは CCD カメラで記録できます。LCI 分析他のアプローチと比較して、タンパク質-タンパク質相互作用定性的と定量的の両方を示しています。アグロバクテリウムベンサミアーナ タバコ葉の浸潤は、一時的な蛋白質の表現のため広く使われているシステムです。ライオンズ クラブ国際協会と一過性発現の組み合わせ、これらのアプローチは COP1 と SPA1 の間の物理的な相互作用にジャスモン酸治療後徐々 に短縮されたことを示します。
概要
その環境と成長を調整するために、植物は感覚、変換、およびシグナリングのキューに対応するエレガントなシグナル伝達経路を進化してきました。リレー競技で走者のような蛋白質、植物シグナル伝達に必要な選手です。タンパク質間相互作用 (PPI) が携帯電話通信のための主要な役割を果たしていること広く認識されています。蛋白質のリン酸化、アセチル化、劣化がすべてターゲット蛋白質とその変更の酵素間の物理的な相互作用に依存しています。たとえば、ジャスモン酸 ZIM ドメイン蛋白質 (JAZ) ファミリーのタンパク質は転写因子 MYC2 との対話、その転写活性1,2を抑制します。PPI の重要性を与えられた植物の interactomes がされている大規模なタンパク質検討最近3,4,5です。さらにこれらインタラクトームの結果では、多様な細胞機能を調整する複雑な規制のネットワークを明らかにします。
PPI を監視するためいくつかの確立された方法があります。イースト 2 ハイブリッド (Y2H) 試金は、PPI 検出のため最も広く使用されている方法です。Y2H は、蛋白質の相互作用を調べる簡単なテス....
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プロトコル
1. 植物 (8 週間) の準備
- 50ベンサミアーナ タバコ種子を 1 mL 5 %naclo と、0.1% トリトン X-100 (V/V) ソリューションおよび種子を殺菌する 5 分を残すを含む 1 つの 1.5 mL 遠心チューブに入れてください。
- リンスの種子滅菌水を 5 回と 200 μ L の滅菌水に種子を中断します。
- 慎重に場所個々 の種 MS 寒天培地 (1 l: (KOH) 培地・培塩 10 g スクロース, pH 5.8 × 1 1% 寒天) 罰金のヒントと発芽を同期する 3 日間の 4 ° C で店中板の表面上に。
注: 微生物汚染を避けるためには、クリーン ベンチでこの手順を実行します。滅菌中がチューブを振るする必要はありません。 - 10 日間の正常な成長条件 (22 ° C、80-90 µmolm-2の-1白い光強度) の下で中板を置き、土に発芽苗を転送します。
注: は土に苗の根を挿入することを確認し、根に損傷を与えない。透明なプラスチックのカバーで一晩湿度を維持するためにトレイをカバーします。 - 16/8 h/明暗サイクルと 70% 湿度制御成長部屋の植物を育てます。7 週齢(名) 形質転換植物Agrobacteriumtumefaciens浸潤 (図 1<....
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結果
3 つの主要なステップは蛋白質蛋白質の相互作用生体内で植物の成長、タバコ浸潤、およびルシフェラーゼ アッセイを含む留学このルシフェラーゼ補完プロトコルで白羽できます。このプロトコルの最も重要なステップは、 (名) ベンサミアーナ葉 (図 1) に液体A. 根頭がんしゅ病菌を浸透させています。
ジャスモン酸 COP1 SPA1 相互作用を減らすことを確認この方法の有用性の例です。COP1 と融合したルシフェラーゼのアミノ末端とカルボキシル末端の半分 (COP1-NLuc) または SPA1 (CLuc SPA1)、それぞれ。COP1 SPA1 相互作用の機能的なルシフェラーゼの相補性の結果します。(図 2)、CCD カメラによるイメージを作成したルシフェラーゼ活性とルミノ (
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ディスカッション
ここで説明されているプロトコルはシンプルで留学生体内でタンパク質間相互作用、再現性と外因性治療中タンパク質の相互作用ダイナミクスを検出するために特に適して。(名) ベンサミアーナ浸透この試金の重要なステップであります。浸潤の成功を確保するため、植物は非常に健康でなければなりません。もう一つの重要な要因は、浸透後ルシフェラーゼ活性をチェックするタイミングです。この質問に対する正しい答えはありません。研究者は別日時間8変動タンパク質発現レベルを見ましたので、ルシフェラーゼを最高のレベルで表す場合を判断する後でルシフェラーゼ活性を監視することをお勧めします。
いくつかの実験で発光を検出ことがありますはありませんが可能です。適切なコントロールなし、偽陰性を除外されませんでした。フルレングス ルシフェラーゼ コントロールが浸潤およびルシフェラーゼ検出の動作を証明するために必要です。その後、まだ推定される蛋白質の相互作用のペアで発光がない場合、イムノブロットに 1 つまたは 2 つのタンパク質が正常に表現されな.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、江蘇自然科学財団 (BK20140919)、清 Lan プロジェクト、中国の国家自然科学基金 (31470375) 優先度学術プログラム開発の江蘇高等教育機関によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 形質転換溶液 | |||
| 10 mM モルホリンエタンスルホン酸 | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM グルコース | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM アセトシリンゴン | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| ルシフェリンワーキングバッファー | |||
| 5 mM ルシフェリンカリウム塩 | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2Oから10ml |
参考文献
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature....
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再版と許可
