フローティング マウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用

房細胞 (TCs) は、頂房とスプール形の細胞体¹によって特徴付けられる消化管上皮細胞のマイナーな散乱コンポーネントです。TCs は 1956年²で最初に説明されたが TC 機能不明で、信頼性の高い TC マーカーの欠如もあって。

榎本らまず girdin³神経系、血管、心臓弁、腱、筋⁴などの非神経組織に発現するアクチン結合蛋白質を特徴付けられます。Girdin の遺伝的アブレーションを持つマウスは、発育と複数の脳異常^4,5,6を表示します。一方、人間 girdin の損失の機能突然変異は進行性脳症、重度障害と早期発症てんかん発作⁷に関連付けられます。

2011 年は、林らは、動的リン酸化チロシン EGFR と Src⁸などチロシンキナーゼを介した 1798 で girdin を識別されます。またリン酸 girdin がアクチンの細胞移行⁸をトリガーする改造のため必要なことを示した。大森らが開発したサイトとリン酸化状態固有人間 girdin 抗体チロシン 1798 (pY1798 抗体) 後藤のプロトコルを次にリン酸化のサイト指示された突然変異誘発を使用して抗体を検証表現のベクトル運ぶフルレングス girdin^9,10。2017 年、久我らその pY1798 は、高い特異性と感度の高い¹TCs をラベルを報告しました。PY1798 抗体はまだ特性内腔側の先端に「房' を含むセル全体形状 girdin の生物学的役割が明らかに優れたの染色特性に基づく以前の TC マーカー優れたと TC のリン girdin をあることを示した機能は明白でない¹を残った。

本研究で説明した方法で蛍光染色、一次抗体標的タンパク質に対してとプライマリに対して蛍光標識二次抗体を使用して組織の特定の蛋白質をマークする組織学的手法は、します。抗体。このメソッドの目的は、組織の限られた経験と高品質の TC の画像を取得する研究者を許可することです。このプロトコルは、フローティングの凍結切片スライド マウントの凍結切片の必要性を避けるため、またはパラフィン セクションを使用します。ただし、浮遊セクションがスライド ガラスからのサポートの欠如のため壊れやすい、切片厚が抗体の透磁率を減らすことができます。このプロトコルには、これらの問題を克服する 2 つのアプローチが含まれています: 1) 浮遊セクション汚損プロシージャ全体の形態を維持するためにゼラチンで全体腸内腔に充満および 2) に低温の抗原検索の使用pY1798 信号を強化します。

ここで説明したすべてのメソッドは、動物愛護と愛知県発達障害研究所利用委員会によって承認された (出願番号: M-03)。

1. 準備

1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 10 L を準備: 32.27 g ナ₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O 4.5 g の 80.0 g 塩化ナトリウムの室温 (RT) で 10 l. のストア ソリューションの最終巻に純水に追加。
2. 手順 1.1 から PBS の最終濃度 0.05% (vol:vol) に polyoxyethylene(10) オクチルフェニル エーテルの 100 μ L との PBS t: 200 mL の 200 mL を準備します。室温ストア
3. 手袋、眼の保護を着て、ショ糖 15% を 10% 中性ホルマリン溶液 50 mL を準備: 7.5 g ショ糖 10% に追加の 50 mL の最終巻に中性ホルマリン (資材表) をバッファリングします。室温ストア
   注意: バッファー 10% 中性ホルマリン中のホルムアルデヒドと吸入または皮膚/眼の接触は危険にできます。慎重に処理します。
4. 200 単位/ml ファロイジン蛍光染料共役ストック溶液 1.5 mL を準備: ファロイジン蛍光染料共役 (1 バイアル、凍結乾燥固体励起と放射の波長で 300 台: 581 nm と 609 nm、それぞれ) の 1.5 mL で中断メタノール。-20 ° C で暗闇の中のストア ソリューション
5. 準備 5 mg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole、塩酸 (DAPI) 在庫ソリューション: N, N-ジメチルホルムアミド (DMF) の 2 mL の DAPI の 10 mg です。-20 ° C で暗闇の中のストア ソリューション
6. 5% ウシ血清アルブミン (BSA) PBS の準備: 10 mL の PBS の BSA の 0.5 g。4 ° C でのストア
7. ニッパーを使わず、18 ゲージ ストレート針の斜めのヒントを削除し、針の内腔 (図 1 a1) を通過する液体を許可するように縦方向に nipped、ピンチャーで端をピンチします。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。

2. 動物解剖と空腸の分離

1. マウスの灌流固定
   1. 手袋を着用し、換気の良い場所で作業します。
   2. 100 mL ガラス製ビーカーを準備、中性ホルマリン、手術用ツール (ハサミ、鉗子)、金属トレイに 10% がバッファリングされる、6-0 ナイロン切り取り縫合、1.7 のように 18 ゲージ ストレート針 22 g 翼針、20 mL の注射器。
   3. 20 mL シリンジ、ガラス ビーカーから読み込むバッファー 10% 中性ホルマリン溶液 20 mL、22 g 翼針をコンセントに取り付けます。
   4. ゼラチン粉末 1 g を 20 mL の PBS (最後の 5% のゼラチン) 50 mL 遠心管中に追加することによって液体ゼラチンを準備します。15 分間漬常温を振ることがなく 50 ° C で 15 分間湯せんで孵化させなさい。
   5. 簡単に渦とゼラチンが完全に溶けるまで別の 15 分は 50 ° C で孵化させなさい。RT でチューブを使用するまで残します。
   6. 頚部転位によってアダルト マウスを安楽死させます。
   7. 金属トレイをステップ 2.1.6 からマウスを置き、手術器具を用いて剣軟骨を介して皮膚に小切開を行います。
   8. 胸部、腹部領域公開に両手で切開を展開します。
   9. 横隔膜を公開する腹膜を開き、両側横隔膜を開きます。
   10. 両側、前腋窩線に沿って胸郭をカット、中心部を公開する胸腺の位置で横方向の切削による胸壁を削除します。
   11. 血を排出し、左の心室の頂点に 22 g 翼針を挿入する右のアトリウムの耳介の小切開を確認します。10% 中性ホルマリン溶液で組織を灌流してプランジャーを押してください。
   12. 骨盤内の臓器を公開した後、肛門から直腸の端を切断し、腸間膜を切断することによって腸を本体と切り離します。
   13. 空腸を分離するには、胃前庭部の肛門側から 4 cm で腸をカットします。残存小腸の肛門の半分を破棄します。
   14. 洗浄手順を容易にするために半分に空腸をクリップします。負荷 10 %20 mL は、20 mL の注射器に中性ホルマリンをバッファー、コンセントに 1.7 の手順で準備 18 ゲージ ストレート針を取り付けます。
   15. 切り取られた空腸腸の内容物を洗い流すため、腸内腔表面 (図 1 a2) を修正するための一方の端から 10% 中性ホルマリン溶液を注入します。
   16. 2.1.15 の手順で説明するように、PBS を注入することにより腸の内腔を洗浄します。
   17. 2.1.15 液体ゼラチンで PBS を置き換えるための手順の説明に従って、腸内腔に液体ゼラチンをフラッシュします。
   18. 6-0 ナイロンを使用して縫合結紮によって切り取られた空腸のすぐ片方の端縫合糸をカット、液体ゼラチンで腸を埋めるし、縫合結紮 (図 1 a3) の反対側の端の近きます。
   19. Cryomold (図 1 a4) の落ち込んでいる部分にソーセージの形をした空腸のセクションに合わせて 4 つの縫合ノットを追加します。
       注: 20 mm × 25 mm × 5 mm 落ち込んでセクションで cryomolds 〜 20 mm 空腸ソーセージのようなセクションは望ましいです。
   20. 50 ml の 4 ° C で一晩 10% 中性ホルマリン溶液にショ糖 15% の組織を吸収します。
       注: 手順は、ショ糖とタンパク質の固定によってゼラチンと組織のホルマリンによってに対する凍害保護作用をください。室温 4 ° C で非固定糊ゼラチンを溶かすに対し、常温では、ホルマリン ゲル化ゼラチンが溶融しません。

3. ゼラチン充填空腸組織の凍結をスナップします。

1. 縫合ノットで腸を切断することによって両端の結紮とソーセージのような腸 3枚 (図 1 a4) を取得します。凍結組織標本作製化合物の埋め込みを追加するための cryomold のソーセージのような部分を合わせます。
2. スナップは凍結液体窒素で冷却イソペンタンで cryomold です。-80 ° c 店 cryomolds
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。

4 浮遊凍結切片を用いた細胞の房の蛍光

1. セクショニング
   1. クライオスタット チャンバー内温度 (CT) とオブジェクト温度 (OT) の両方を -22 ° c. に設定します。少なくとも 15 分クリオスタットチャンバー内 cryomold で場所、凍結するティッシュのブロックします。
   2. 35 mm ディッシュに 3 mL の PBS を追加します。
   3. Cryomold から凍結するティッシュのブロックを外し、ブロックを空腸の横断を公開するかみそりの刃で半分にカットします。1 つをマウントしてかみそりの刃で切断面を断面チャック (クライオスタット アダプター) のブロックの半分。
   4. 30 μ m 厚いセクションにゼラチン充填空腸をセクションします。優しく 4.1.2 (図 2 b、右) 準備した 35 mm ディッシュにセクションを転送するための鉗子を冷凍を使用。
2. 一次抗体のアプリケーション
   1. 3 回に 3 ml の PBS T 相互シェーカーで穏やかな揺れで各 5 分 35 mm ディッシュの浮遊セクションを洗浄 (約 36 回/分)。
   2. 抗原検索ソリューションを準備: 2.7 mL 純水に抗原検索ソリューション集中 (材料表) の 0.3 mL。浮遊セクションを含む 35 mm ディッシュに抗原検索ソリューションの 3 mL を追加します。
   3. ふたを閉じ、皿とビニール テープのストリップと蓋の間のギャップをシール、揺れなし 50 ° c 3 時間ハイブリダイゼーション インキュベーターで孵化させなさい。
   4. インキュベーターと 20 分間常温の涼しいから皿を削除します。ビニール テープを除去した後、5 分各 3 mL の PBS T と穏やかな揺れのための 3 回のセクションを洗います。
   5. PBS-T を吸引し、セクションにブロッキング液 (材料表) の 5 滴を追加します。RT で穏やかな揺れで 5 分間インキュベートします。
   6. 一次抗体溶液を調製: リン Y1798 (pY1798) を girdin 抗体 (材料表) の 5 μ L の PBS で 5% BSA 495 μ L。(ブロック ソリューションでは、削除する必要はありません) セクションに一次抗体液 500 μ L を追加します。
   7. 加湿インキュベーション室に皿を置き、穏やかな揺れで 4 ° C で一晩インキュベートします。
      注: 一晩インキュベートは最大 3 泊まで拡張できます。
3. 二次抗体のアプリケーション
   1. 3 回 5 分間各 3 mL で穏やかな揺れで PBS T のセクションを洗います。
   2. DAPI の希釈原液を準備: DAPI 原液 (ステップ 1.5) 998 μ L の PBS の 2 μ L。
   3. 二次抗体溶液を作る: 476 μ L の PBS、DAPI 薄めた、ファロイジン蛍光染料共役原液の 12.5 μ、1 μ L ヤギ抗うさぎ IgG 蛍光色素共役の 10.5 μ で 5 %bsa (波長: 励起 496 nm、発光 520 nm)。
   4. PBS T 後、二次抗体溶液を適用し、穏やかな揺れで 30 分常温遮光インキュベーション室で孵化させなさい。
   5. 5 分各 3 mL の PBS T と穏やかな揺れのための 3 回のセクションを洗います。
   6. 最終的な洗浄後 PBS T を削除し、3 mL の PBS polyoxyethylene(10) オクチルフェニル エーテルを欠けているに置き換えます。実体顕微鏡に皿を転送します。
   7. 白いガラスの MAS コート スライドと転送 1 つ腸セクション P200 ピペット先端部を用いた液滴に皿の中央に液滴の PBS の場所 200 μ。
   8. 実体顕微鏡下のセクションの配置を調整した後に、セクションを囲むすべての残りの PBS を吸い出しなさい。
   9. 水土台メディアの 20 μ L を追加し、メディアの上に 20 × 20 mm coverslip を置きます。
   10. すぐにキシレン ベース マウント メディアで coverslip エッジをシールします。木製・ マッペにスライドを配置でき、2-3 h の常温固化するキシレン ベース マウント メディア。
       注: プロトコルはここで一時停止することができます。2-3 週間室温光シールドのスライド ボックスにスライドを格納できるメディアをキシレン ベース マウントが固化した後

5. 共焦点顕微鏡

1. 共焦点顕微鏡の 63 × 対物にイマージョン オイルを置きます。Coverslip スライドを下げて、ステージにスライドを配置します。
2. レーザー波長 405、488、555 nm で取得 TC の画像をデジタル化 (.tiff) tiff 形式で画像を保存します。
   注: 蛍光染料の適切な検出フィルター セットを選択 (すなわち、励起/蛍光マキシマ: 358/461 nm、490/525 と 590/617)。

空腸のゼラチン充填

ゼラチン充填 (図 1 b) の利点は、ゼラチン充填マウス腸の典型的な手順 (図 1 a) を示します。簡単に言えば、18 ゲージ ストレート針の斜めのヒントは、ピアスの腸の壁 (図 1 a1) に対して保護するために削除されました。ゼラチン充填を使用して達成された 10% は液体ゼラチン( で充填する前に切り取られた空腸のセクション腸をフラッシュして腸の内腔の表面 (図 1 a2) を修正するための一方の端から挿入中性ホルマリンをバッファリング図 1 a3)。結果のソーセージのような部分 (図 1 a4) が埋め込まれた、冷凍、そして横で区分クライオスタットで 30 μ m の厚さにスライス。ゼラチンの記入がない場合は、空腸のセクションはキンク、後方スイングする絨毛を許可する (図 1 b、左) に傾向があります。ゼラチン充填はセクションの円形のディスクを保持し、(図 1 b、右) 絨毛の直立位置を維持します。画像は、浮遊空腸のセクションの形態を維持する充填ゼラチンによってもたらされるメリットを明確に示します。

腸内房細胞の成功イメージング

pY1798 抗体は、ドットのしみが付くこと、西部にしみが付くこと、パラフィン セクション染色、染色、雪解けに取り付けられた cryosection またはフローティング cryosection1,9を染色を含む変数免疫染色技術を適用できます。このプロトコルでフローティング凍結切片での蛍光染色の tc pY1798 抗体、ファロイジン、TCs1の構造特性を発揮する染色 DAPI を使用してマウスの腸に着目。一般に、TCs 絨毛先端から地下室1約 1 TC/100 上皮細胞の割合で点在しています。代表的な結果表示、pY1798 が再現性をもってスプール形相馬と堅牢な信号結露が TC1 の ' 房' から突出に対応、強く染色内腔側先端の細胞質膜を含む全体の TCs を delineates (図 2 a-2 b)。一方、ファロイジン ファロトキシン、タマゴテングタケ、キノコから有毒な二環式 heptapeptides の家族あり、アクチン フィラメント (アクチン)、親和性の高い腸刷子縁を形成する絨毛の存在であります。11. ファロイジン 1 x 108 と目立つようにマーク、肥厚した刷子縁房1から伸びる根の質量に対応します。したがって、pY1798 信号 (スプール形相馬、内腔側先端に信号凝縮) 目立つように厚くファロイジン正刷子縁との一貫性のある共局在を示しますこのプロトコルが正常に関係なく、TCs を識別彼らが絨毛で(2 a を図)または(図 2 b)地下室にあるかどうか。

低温抗原検索は浮遊セクションを汚すための効果的です

95-99 ° C で熱による抗原検索はパラフィン切片、凍結切片スライド マウントの分析に広く使用されます。しかし、このようなセクションがスライド12でサポートされているスライド マウントのセクションよりもより一般的に壊れやすいために、ダメージを与えず浮遊セクションにこのアプローチを適用することは難しい。低温抗原検索 (3 h の 50 ° C) から水のお風呂を使用して影響を及ぼさない形態ブラインドの抗原検索の客観的効果を行った予備実験で浮遊空腸のセクションのテストと統計学的に低温の抗原検索(図 3)の有効性を確認しました。

凍結切片の形態学的保全のため空腸部図 1: ゼラチン充填
ゼラチンでマウス腸腔内充填の手順の写真を(A) 。(A1)18 ゲージ ストレート針の斜めのヒントは、腸壁の穿孔を避けるために削除されました。(A2)中性緩衝ホルマリン溶液 (10%) は、腸の内容物をフラッシュおよび腸の内腔表面を修正するクリップされた空腸の一方の端に注入しました。(A3)切り取られた空腸は液体ゼラチンと 6-0 ナイロン縫合糸(黒矢印)を使用して結紮両端でいっぱい。(A4)4 つの縫合ノット(白い矢印)既存の縫合糸の結び目(黒矢印)の間に配置をもたらした 3 つの短い小品。組織は、2 つの示された位置(白い矢印)でソーセージのような 3枚に分けるでしょう。(B)ゼラチン充填のフローティング cryosection 形態に有益な効果。ゼラチン充填なしセクションがちキンク、下位(左); 簡単にスイングする絨毛を許可します。ゼラチン充填、30 μ m 厚いセクション ディスク形状の維持し、腸絨毛の直立位置は保存状態(右)。画像は、ノマルスキー微分干渉コントラストを使用して撮影されました。スケール バー、1 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: マウス腸内の代表的な蛍光画像房細胞
TCs 絨毛(A)や地下室の共焦点の蛍光画像(B)、フローティング マウス腸のセクションで部位特異的に染色し、1798 (チロシンのリン酸化 girdin に対するリン酸化状態特異的抗体pY1798、緑、最適な励起/蛍光波長 490/525 nm)、ファロイジン (赤、590/617 nm), 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、青、358/461 nm)。低倍率の画像 (50 μ m スケール バー) に白いボックスによって囲まれた領域 (尺度バー、10 μ m) 右上で展開されました。pY1798 抗体再現性をもって染色内腔側先端 (矢印)、膜、およびスプール形 TC 相馬の細胞質に存在 ( (A), 絨毛またはクリプト(B)) の場所に関係なく、TCs を染色します。ファロイジン染色 (矢印) で目立つように肥厚したブラシの境界線は TCs の別の独特の記号この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 低温抗原検索を強化 pY1798 蛍光抗体法
実験プロシージャの 2 つのグループは、低温抗原検索の有効性を確認するために比較しました。浮遊空腸のセクション (30 μ m 厚い、n = 13) から単一の冷凍ブロックは 2 つのグループに分け、各グループからのセクションは、完全なプロトコルに従う染色されたや同じプロトコルが欠けている低温の抗原検索 (ステップ 4.2.2)。染色後のセクションは、グループ番号が付いた個々 のスライドに搭載されていた、マスキング テープで覆われていた各スライドにラベルします。すべてのスライドがシャッフル、テープ上の新しい番号でラベル付け、FITC フィルターを蛍光顕微鏡下で観察されました。表示の pY1798 肯定的な TCs の合計数の平均と各グループの棒グラフ (平均 ± 標準偏差) で表示されていた。2 つのグループの間の平均のカウントを比較する両側 t 検定を行った。0.05 以下の P 値が統計的に有意と考えられました。低温抗原検索は、pY1798 蛍光抗体法の有効性を大幅改善。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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