暗殺者のバグやその他のカメムシの昆虫から毒の毒素を収穫

かめむし類の毒は、強力生理活性物質¹です。たとえば、キスのバグ (クロタマゴバチ)、ベッドのバグ (Cimicidae) などのカメムシの吸血の毒/唾液分泌を容易に止血²を破壊して給餌。これらの毒の毒素は、凝固、血小板凝集と血管収縮、痛みなど複数の経路をターゲットし、経路をかゆみ。他のほとんどのかめむし類種から毒は吸血するのではなく、捕食を容易にするために合わせられます。その毒は、麻痺、死および無脊椎動物^3,4に注入する組織の液状化を引き起こします。脊椎動物に注入される毒液抜本的な効果はあります。例えば、脊椎動物にサシガメHolotrichius innesiから毒の注入により痛み、筋麻痺、出血;このバグによってマウス envenomated は呼吸麻痺⁵のためすぐに死にます。

トランスクリプトームおよびプロテオーム研究は、いくつかのかめむし類の毒のタンパク質組成を明らかにしました。捕食性の種の毒は、プロテアーゼ他酵素とペプチド及びタンパク質の未知構造と機能^6,7、8に富んでいます。バグ キス毒は、血液凝固、血小板凝集や血管収縮^2,9メンバーに深く影響を与える triabin タンパク質ファミリーが豊富です。ただし、どの毒素の根底にある毒のほとんどの生物活性は知られていません。たとえば、キス バグブラジルサシガメ ジャガイモの毒は、鎮痛剤、ナトリウム チャンネル¹⁰を阻害すると報告されているが、解明する責任のコンポーネントが残っています。同様に、どのコンポーネントのサシガメ毒麻痺や痛みの原因は知られていません。特定毒生物活性と構造と、新しい毒の毒素の機能を特徴づける担当の毒素を識別するための前提条件は、毒を得ています。

電気^{5,6,7,8,11,12,13}守備の挑発が毒を heteropterans から入手します。応答^4,8、機械的に圧迫、胸郭^12,14,15,16毒液腺^{8,17 を解剖 ,18,19,20,21,22}、および²³ムスカリン性アセチルコリン受容体のアゴニストのアプリケーション。2 つの独立したルーメン、前方メイン腺 (AMG) と後部主な腺 (PMG) 主な腺から成っているかめむし類の毒腺の形態は複雑に潜在的な長所と短所の任意のメソッドを判断として付属腺 (AG) を関連付けられています。これらの異なる腺コンパートメント獲物の捕獲や防衛、口腔外消化^8,17を含むさまざまな生物学的機能特化する可能性があります異なるタンパク質の分泌物を生成します。Peiratine と ectrichodiine の暗殺者バグで AMG は獲物の捕獲および口腔外消化¹⁷PMG に関連付けられています。しかし、harpactorine の AMG⁸防御毒を分泌する仮説があるに対し、 Pristhesancus plagipennis PMG のバグは獲物の捕獲や消化を特化されています。AG は、サシガメ⁸小さな分泌機能を持つ、巨大な水のバグ²³プロテアーゼ ストレージの主要なサイトに記載されています。明らかに、さらに作業は様々 なカメムシ サブグループ間で各腺区画の機能を明らかにする最も毒の毒素の機能を決定する必要があります。本報告ではこの目標に向かって heteropterans から毒の毒素を収穫するためのプロトコルについて述べる。

このプロトコルは、レスポンシブル ・ ケアと教育・研究における動物の使用(PPL 4.20.11) と同様に、国立健康医学研究議会ののケアのためのオーストラリアのコードとの使用でクイーンズランド大学のポリシーに準拠します。科学的な目的のための動物(8^th版 2013)。

注意: すべき envenomated は暗殺者のバグを処理するとき注意してください。守備の毒を吐く種を処理するとき、目を保護するために注意してください。全体で世話をする実験動物を傷つけないように。これには、輪ゴムなどの拘束圧の監視、および、テングが壊れていないことが含まれます。

注: 必要に応じて、0.5-2 の CO₂の露出によって動物を anaesthetize 分や毒で収穫前の 4-10 ° C に冷却を目指す 1-3 安全な移送と拘束を容易にします。Anaesthetization は必須ではないが、アジャイルまたは強力な標本の安全制限を容易にする可能性があります。しかし、動物は毒を収穫できるように目がさめている必要があります。プロテアーゼ阻害薬を追加するかどうかを決定するときダウン ストリーム アプリケーションを覚えておいてください。

1. 電気刺激による毒の毒素の収穫

1. ライブ標本から毒素を収穫するを取得します。
2. 正極・負極の事前に用意されたプラスチック ピンセットは、どちらかの先端にマウント。電化のピンセットを electrostimulator または電圧の調整が可能な定電圧源に接続します。
   1. 小さな (~ 10 mm) と大 (〜 25 mm) サシガメ、15 と 25 V のピーク電圧をそれぞれ使用します。
   2. 巨大な水のバグなど大きな heteropterans は、最大 40 V を使用します。
3. 胸部にゴムバンドを使用して、プラットフォームにそれらのストラップがライブのバグを抑制します。
4. 適切な収集のヒントに口吻の先端を配置します。サシガメ、P200 ピペット チップを使用します。巨大な水のバグ、P200 先端開口部のサイズを増やすために下肢をカットします。
   1. 優しく清潔なピンセットの閉じたペアでテングを持ち上げ、テングの終わり上コレクション先端の開口を押してください。
   2. 必要に応じて、収集に口吻を配置する前に取り込み 〜 5 μ L の純水がヒントします。これは収穫された毒が薄くなることが毒、チップ内部の残りの損失を低減します。
5. 電気刺激を適用します。2.5 M NaCl/50% グリセロールなどの導電性ゲルの刺激電極を浸しなさい。胸部に電極を適用します。Belostomatids、頭の背側後面に 2 つの電極を適用します。
6. Autodegradation を防ぐために毒を格納します。毒を押し出し後、-60 ° C または-20 ° C でチューブやプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含むチューブにすばやく転送します。
7. 1.5 と 1.6 の手順を繰り返して十分な毒を取得または今後さらに毒はありません。

2. ハラスメントによる毒の毒素の収穫

1. 毒を収穫するため動物を準備し、1.1 と 1.3 1.4 のサブセクションで説明するようコレクション前庭で口吻の先端を配置します。
2. 毒が自然に押し出されて、2.3 の手順に進みます。ない場合は、優しく触って脚、腹部と触角にピンセットで毒を生成まで動物を苦しめます。
3. すぐに必要な場合、管含むプロテアーゼ抑制剤のカクテル、-60 ° C または-20 ° C の管へ毒を転送します。

3.「吐き」種の毒から嫌がらせで毒の毒素の収穫

1. Anaesthetize、または、部分的に anaesthetize、任意の時期尚早守備吐きようにエンクロージャから取り外す前に昆虫。
2. 毒吐く動作を引き起こします。含まれており、標準 90 x 16 mm ペトリ皿の深い蓋を使用して虫の位置を変更します。防ぐため飛行する昆虫の上 1-4 cm のやや後方の蓋を保持します。ほとんどの昆虫はしばしば立て続けに数回を吐き出すでしょう。すべての毒を皿の下側に収集します。
3. ペトリ皿の下側に毒を収集するには、10 μ L の純水で洗浄します。すばやく-60 ° C または-20 ° C でチューブやプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含む管にそれを転送します。

4. 腺解剖によって毒の毒素の収穫

1. 動物を犠牲に。大きく anaesthetize またはを使用して動物を殺す > CO₂を 5 分露出。動物のハウジング筐体の空気穴に直接パイプを純粋な CO₂ 。
2. ピン昆虫解剖トレイ。暗殺者のバグの腹側表面 (4.3) を解剖します。巨大な水のバグの背側表面 (4.4) を解剖します。
3. 腹側郭清
   1. 毒液腺に穴をあけることがなく昆虫を押しながら後部の腹部に 3 本のピンを挿入します。
   2. 小型のメスを使用して腹部の腹側表面に短い正中切開をカットします。外骨格のみをカットし、内部構造を損傷しないように注意しながら、頭を前方正中切開を拡張するのにミニチュアはさみを使用します。
   3. 内部構造を公開するには、するには、正中切開から昆虫の側に伸びる複数の水平カットを確認します。内部構造を明らかにする腹側の外骨格の各フラップ、ピンバックします。
   4. 大きなサシガメの中間腹部、前腹部、最初と 2 番目の足の間と第 1 戦の前に 4 つの横切開を作る。
4. 背郭清
   1. 基地の近くの翼を削除します。毒液腺に穴をあけることがなく昆虫を押しながら後部の腹部に 3 本のピンを挿入します。
   2. ミニチュアはさみやメス、外骨格のみをカットし、内部構造を損傷しないように注意しながら使用して腹部に頭から正中切開をカットします。
   3. 昆虫の 2 つの半分を離れて強制的に。公開されている内部の空洞を残して昆虫の長さに沿って横方向にいくつかのピンを配置します。
   4. ピンセットを使用して飛行筋肉を削除します。
5. 郭清トレイを洪水します。簡単に可視化バグが内部構造をフロートし、するを許可する浸水までは、PBS を追加します。
6. マイクロ剪刀、ピンセットを使用すると、気管や神経組織結合を慎重に取り外します。毒液腺のように細長い、消化管の各側面に沿って延びる透過する構造体です。
   1. 前葉および後葉門部で会った 2 つのダクトとその特徴的な外観、主な腺を識別します。
   2. 必要な場合は、肺門からダクトをトレースして付属腺を識別します。門部から発せられる 2 つのダクトを切断することによって主要な腺を無料します。
7. 必要な腺ルーメンを収穫します。30 μ L の PBS または PBS を含有した氷の腺を遠心機に転送プラスのプロテアーゼ抑制剤のカクテル。鋭いピンで腺を槍します。
   1. 10 s および腺ルーメンを空にして (1 分、5,000 × g、4 ° C) 遠心分離機の渦。ピンセットを使用して腺組織を削除します。
8. 毒素抽出物を明らかにします。遠心分離機 (5 分、17,000 × g、4 ° C) 任意の固体粒子、上澄みを保持とペレットを破棄を削除します。Autoproteolytic の劣化を防ぐため-60 ° C または-20 ° C で保存します。

P. plagipennis harpactorine と reduviine Platymeris ラダマンテュスなどのいくつかのかめむし類種は確実に電気刺激 (表 1) への応答では毒の大量 (5-20 μ L) をもたらします。一般に、ほとんどの peiratine、reduviine、および harpactorine のバグは、このメソッドへの応答で毒を生成します。Stenopodaine バグの間では、電気刺激はOncocephalus sp. Thodelmus sp ないから毒を誘発しました。サンプリング holoptiline および分類のバグには、電気刺激への応答の重要な毒 (例えば十分な質量分析法による解析) が出なかった。Belostomatid バグや略奪ハモグリムシから毒を収穫する電気刺激を使用もできます。しかし、サソリ (タイコウチ) の電気刺激は毒テングからではなく頭部腺のみの内容のリリースを誘発しました。いくつかの種の電気刺激による毒を収穫する失敗は毒液腺と毒8のリリースを制御する生理学的メカニズムの形態学的複雑さのためらしい。

電気刺激、 P. plagipennis、Havinthus rufovariusreduviids、 P. ラダマンテュスと belostomatidタガメ幼虫 distinctifemur意志のための毒を自発的に解放に加えて、テングから毒を取り出す中に処理します。このような毒吐出よく守備表示と一緒に伴われます。P. ラダマンテュスは、守備も毒吐く4を我々 が気づいていない他のサシガメ種のヘビ24やスパイダー25で発生します動作します。

SDS-PAGE およびプロテオミクス実験は、電気刺激や嫌がらせによって収穫される毒がタンパク質が豊富な6,7,8だと示します。蛋白質は、無機イオンや他の物質に毒が含まれている可能性がありますでもあるが、材料の存在の大部分を占めています。電気刺激や嫌がらせによって通常得られるサシガメ毒は、100 ペプチドやタンパク質 (図 1図 2) を含んでいます。Belostomatid の毒は、リゾリン13で金持ちになる以前報告されています。Belostomatine 水バグDiplonychus 大らかから毒の赤外線吸光度スペクトルは蛋白質とリゾリンの両方のコンテンツと一致しています。Lethocerine L. distinctifemur、蛋白質およびないリゾリン6のみで証拠が分かった。

クモ毒26の報告、かめむし類昆虫から採取した毒濃度と使用される昆虫および収穫する方法によって組成が変化する可能性があります。希薄化後の毒サンプルの紫外分光 50 〜 250 の高蛋白質濃度と一致して、原液の毒 50-250 (10 mm パスの長さ) の吸光度値 (280) によって示される mg/mL7,12,19。獲物の剥奪は、pH27の連続の減少と同様、毒濃度と中風の人に潜在的な3連続増加が発生する報告されています。ただし、長期の飢餓は、条件と死の損失になります。濃度だけでなく、heteropterans から収穫される毒、メソッドはその組成は影響可能性があります。サシガメP. plagipennisから毒の毒素組成は、それが電気刺激や嫌がらせ8で収穫されるかどうかによって著しく異なっていた。P. plagipennis、場合これは嫌がらせが AMG の内容を得られたに対し、電気刺激、PMG の内容を降伏に起因する示されました。毒を用いて電気刺激、しかしない嫌がらせ、強力麻痺した獲物の昆虫 (図 3)。しかし、それは明らか他のサシガメ科または他のカメムシ目にどの程度この結果を一般化できます。

毒腺を解剖によって直接毒を収穫と腺組織 (非毒) 蛋白質の汚染を犠牲にして回避に毒腺の制御メカニズムことができます。関係なく、切り裂かれた材料から得られるエキスは、活性/毒性の試金に使用できます。たとえば、PMG、AMG、 P. plagipennis、上記のプロトコルを使用して準備の AG のエキスを液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法による8を使用して行った。このプロセスは、合計 182、114、うちは、45、51、12 は推定ハウスキーピング タンパク質として分類される残りのタンパク質とアミノ酸シーケンスの特性に基づいて推定毒腺タンパク質として分類された合計で 71 蛋白質を識別されます。昆虫に PMG、しかしない AMG や AG のエキスの注射は、まひ状態および死8で起因しました。

表 1: 分類群の特異性 heteropterans から毒を収穫するための方法。

図 1: 2D SDS-PAGE スポットのクロマトグラフィー-タンデム質量分析と毒の HPLC 分画によって検出される蛋白質で採集されたP. plagipennis (プロトコル 1) 電気刺激による、豊富なプロテアーゼ、カブ ドメイン蛋白質とかめむし類毒家族 1 蛋白質を示すします。(A) 第 2 SDS ページのゲル原油のp. plagipennis毒、蛋白質家族 LC ・ MS/MS ゲル スポットの識別を示します。高速液体クロマトグラフィー (B) 収集した分数のクロマトグラフィー-タンデム質量分析によって識別されるタンパク質ファミリーを示す、 p. plagipennis毒の分別からクロマト グラム。許可7で再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: シーケンスの毒で各主要蛋白質クラスに属するの割合P. plagipennis.許可7で再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3:P. plagipennis 電気刺激、しかしない嫌がらせによって得られる毒麻痺昆虫。(A) 電気刺激や嫌がらせ、または水、クリケットの脱出によって得られる毒を注射する効果。腹部と上を向いたシャーレのふたを脱出する時間に注入された 0.17 μ L 毒と同じ毒条件ごとに (最大 300 s で s、平均 ± SD) 得点されました。(B) 用量-反応曲線のP. plagipennisから電気刺激によって得られた毒によって脱出成功を阻害します。許可8で再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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