F₁の分離-寄生原生トリパノソーマから atp アーゼ

F 型 ATP 合成酵素は膜結合型細菌、ミトコンドリア、葉緑体の ATP の形成と膜をエネルギー伝達を渡るカップル プロトン透過経路が多蛋白質複合体を回転させます。ATP 合成の回転機構の分子の詳細は、精製された細菌やミトコンドリア ATP 合成酵素とその subcomplexes¹の構造の研究のために主に知られています。F 型 ATP 合成酵素は膜組み込みと膜外因性基に編成されます。F₁として知られている膜外因性部-atp アーゼ、ATP または逆の反応にアデノシン二リン酸 (ADP) のリン酸化が発生する 3 つの触媒部位が含まれています。F₁-膜固有の部位から実験的 atp アーゼがリリースされる加水分解、しかしない、ATP を合成する能力を維持しながらことができます。F_oと呼ばれる膜結合型部門は、酵素の中央部分の回転を駆動するタンパク質輸送を仲介します。F₁と F_oセクターは、中枢および末梢の茎によって接続されます。

₁F を浄化するために、最初の試み-ATPase 出芽酵母とウシ心筋ミトコンドリア日付 1960 年代に戻る。これらのプロトコルが使用される抽出アンモニウムまたはプロタミン硫酸塩沈殿物、続いてオプション クロマトグラフィー ステップと熱処理^{2,3,4 分画の超音波によって中断されたミトコンドリア ,5,6}。浄化は大幅改善、F₁を容易に解放するクロロホルムの使用で簡素化-ミトコンドリア膜 ATPase の断片⁷。クロロホルム抽出、F₁の抽出に使用された様々 な動物、植物、細菌の源 (例えばラット肝⁸トウモロコシ⁹アルムのニンジン¹⁰、および大腸菌大腸菌型 Atpase ¹¹)。さらにクロロホルム リリース F₁の精製-atp アーゼ アフィニティまたはサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) で得られた x 線結晶構造解析による高分解能構造解析に適していた、非常に純粋なタンパク質複合体、として₁F の構造によって文書化-ウシ心筋^12,13と酵母¹⁴ATPase。F₁-atp アーゼ構造も耕しにくい生物から決定した、したがって、最初の生物学的材料の量は限られていた。この場合は、F₁-atp アーゼのサブユニットが人工的に表現し、エシェリヒア属大腸菌、複雑に組み立てし、全く異種酵素の親和性クロマトグラフィー経由でタグ サブユニットを精製しました。このようなアプローチは、F₁の決定につながった-2 好熱性細菌種や株中等度好熱¹⁵ Caldalkalibacillus thermarum^16,からの atp アーゼの構造¹⁷です。 ただし、この方法は適していませんむしろ真核生物の F₁型 Atpase それは原核生物 protheosynthetic 装置、翻訳処理、および複雑なアセンブリに依存しているので。

クロロホルムを用いた抽出 F₁を分離に使用していた型 Atpase 単細胞ミナミハタンポ寄生虫cruzi¹⁸とt. グリコシルホスファチジルイノシトール¹⁹アメリカを引き起こす重要な哺乳類の病原体から、アフリカの trypanosomiases、それぞれ、およびイネ昆虫寄生虫クリシジアファシクラータ²⁰から。これらの浄化は、F₁の簡単な説明だけに主導型 Atpase、組成、構造、および複合体の酵素学的性質を完全に特徴づける下流のアプリケーションが使われていませんので。F₁の最適化方法について説明します- t. 血の培養昆虫のライフ サイクル段階から atp アーゼ浄化。メソッドは、ウシおよび酵母 F₁型 Atpase^21,22の隔離のための確立したプロトコルに基づいて開発です。プロシージャには、高純度、均一酵素体外酵素と阻害アッセイ、適した質量²³、および構造決定²⁴によって詳細なプロテオーム解析が得られます。浄化のプロトコルと F₁の知識-atp アーゼ構造の原子レベルが低分子阻害剤を識別し、アフリカの trypanosomiases の新薬の開発を支援する画面をデザインする可能性を開きます。さらに、プロトコルが F₁を浄化するために合わせることができる-他の生物から atp アーゼ。

1. バッファーとソリューション

1. 次に挙げたソリューションを準備します。液体クロマトグラフィーのすべてのバッファーをドガします。ちょうど使用する前に ADP、benzamidine、およびプロテアーゼ阻害剤を追加します。
   1. アミノカプロン酸 (ACA)、およびプロテアーゼ阻害剤 (10 μ M amastatin 50 μ M bestatin 50 μ M ペプスタチン、50 μ M leupeptin、50 μ M diprotin A) 塩酸 (トリス-HCl) ph 値 8.0 0.25 M ショ糖 5 mM 5 mM benzamidine のバッファー a: 50 mM Tris バッファーを準備します。
   2. バッファー b: 50 mM トリス塩酸 pH 8.0、0.25 M ショ糖、4 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、benzamidine 5 mM、5 mM、ACA 1 mM ADP、およびプロテアーゼ阻害剤 (10 μ M amastatin 50 μ M bestatin 50 μ M ペプスタチン、50 μ M leupeptin、50 μ M diprotin A) を準備します。
   3. Q 列バッファーの準備: 1 mM ADP、ACA、5 mM 5 mM benzamidine 10 mM MgSO₄20 mM トリス塩酸 pH 8.0、4 mM EDTA。
   4. Q カラム溶出バッファーを準備: 1 M NaCl を Q 列バッファー。
   5. 秒のバッファーを準備: 20 mM トリス塩酸 pH 8.0、10 mM MgSO₄, 100 mM の NaCl、1 mM ADP。
   6. クロロホルム飽和 2 M トリス-HCl pH 8.5 を準備します。クロロホルムをミックス 2 M トリス-HCl pH 8.5 スクリュー キャップ ボトルで約 1:1 の比率で、振る、有機および水様段階別を聞かせてし、pH 指示薬紙のストリップと上方の水層の pH を測定します。常温で保存します。使用の直前にもう一度シェイクさせ別のフェーズ。下層のクロロホルムを使用します。
      注意: クロロホルムは揮発性と眼や皮膚に刺激を与えるです。発煙のフードで働いてください。振るときは、安全眼鏡を使用します。

2. サブ ミトコンドリア粒子の調製

1. 低張性換散²⁵ 1 x 10¹¹から 5 mL の氷冷バッファー A. 維持手順 3.2 まで冷蔵して、サンプルの procyclic t. グリコシルホスファチジルイノシトールの 2 x 10 の¹¹セルによって分離ミトコンドリアの小胞 (mitoplasts) を再懸濁します。
2. ビシンコニン酸 (BCA) 蛋白質の試金²⁶製造元の指示に従って、懸濁液のタンパク質濃度を決定します。
   1. 純水ウシ血清アルブミン (BSA) の希釈系列を使用して、標準曲線を作成します。少量の 20-100 倍超純水 BSA の範囲の基準に適合する試料を希釈します。
   2. サンプルの総蛋白量を計算し、追加のバッファー A. で薄めて 16 mg/mL に蛋白質の集中をもたらす
3. 7 懸濁液の超音波処理によって逆小胞と膜部分に mitoplasts をフラグメント 15 x 直径 3.9 mm、陰極とインパルスあたり 70 〜 100 J の総エネルギーと s。超音波ホモジナイザーでエネルギー出力が表示されない場合は、最大電力の 50% での最適化を開始します。30 の氷のサンプルをインキュベート衝動間 s。超音波処理後、懸濁液に少し暗くなります。
4. 16 時間 54,000 × g、4 ° C で 5 時間 98,000 x g の遠心によるフラグメントの膜堆積物上清をデカントしクロロホルム抽出を続行またはフラッシュ凍結沈殿物を液体窒素で、-80 ° C で保存

3 F₁のリリース-クロロホルムによる膜 ATPase

1. 小さな Dounce ホモジナイザーを用いてバッファー B にミトコンドリア膜のペレットを再懸濁します。バッファー B のボリュームに基づいてバッファーの合計使用手順 2.1 と 2.2 を使用して、次の数式で計算: ボリューム (バッファー B) x 12/21 ボリューム (バッファー A) を =。懸濁液を 15 または 50 mL の円錐管に転送します。
2. 氷からサンプルを削除し、さあ今からサンプルと室温で使用するすべてのソリューションを維持します。
3. クロロホルム飽和 2 M トリス-HCl pH 8.5; を追加します。懸濁液の半分の量を追加するクロロホルムのボリュームに相当します。キャップをしめてください。丁度 20 のため精力的にそれを振る s. はすぐに部屋の温度で 5 分間の 8,400 x g でそれを遠心分離します。
4. 1.6 mL マイクロ チューブに上部曇り水相を転送します。プロテアーゼ阻害剤 (10 μ M amastatin、50 μ M の bestatin、50 μ M ペプスタチン、50 μ M leupeptin、50 μ M diprotin A) クロロホルム処理により除去阻害剤を交換するを追加します。室温で 30 分間 13,000 x gでサンプルを遠心します。新鮮なチューブに上清を転送し、不溶性物質を削除する遠心分離を繰り返します。

4 陰イオン交換クロマトグラフィー

1. 吸光度 280 まで 5 mL/min の流速で Q 列のバッファーを持つ高速蛋白質液体クロマトグラフィー システムに接続されている 5 mL 陰イオン交換 (Q) コラムを平衡させ nm と導電率 (約 50 mL のバッファー) を安定させます。
2. ステップ 3.3 吸光度まで待機を 1 mL/分の流量で釣合い列に 280 から上澄みを読み込む nm がバック グラウンドで安定します。Q カラム溶出のバッファーを 0% から 100% 収集の 1 mL の一部分を 0.5 mL/分の流量での 25 mL 線形グラデーションを適用します。
3. PH 8.0 でプルマン atpase 活性アッセイ² ATP 加水分解活性の主要な溶出ピークに対応する個々 の分数の試金します。反応混合物の 1 mL あたり各画分の 10 μ L を使用します。ATPase 活性を示す画分をプールします。必要に応じて、ナトリウム ドデシルりん酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) の各分画の 10 μ L を分離し、個々 の F₁を視覚化するブルーでゲルを染色-atp アーゼ サブユニットと汚染蛋白質。
4. 集中スピン列を用いた 200-500 μ L に 100,000 MWCO PES フィルター膜限外濾過法によるプールのサンプルは秒または室温で一晩サンプル ストアに進みます。

5. サイズ排除クロマトグラフィー

1. 0.5 mL/min の流速で秒バッファーの少なくとも 48 ml (2 列ボリューム) 液体クロマトグラフィー システムに接続されている秒コラムを平衡させ。
2. 列にサンプルを適用し、収集 0.25 mL 分数 0.25 mL/分の流量でクロマトグラフィーを実行します。
3. SDS-PAGE の紫外_{280 nm}吸光度トレースのピークに対応し、ブルーで、それらを染色した分数の 10 μ L を実行します。最初の主要なピークを含む F₁-atp アーゼ。プルマン分子アッセイによって ATP 加水分解活性とアジ化感度のピークに対応する分数の試金します。BCA アッセイによってタンパク質濃度を決定します。
4. 精製 F₁を維持-常温 ATPase 下流用浄化後 3 d でそれを使用しています。また、> 1.5 mg/mL、沈殿物飽和硫酸アンモニウムを混合することによってそれを pH 8.0 (ボリューム x 1.2) に調整する 100,000 MWCO PES フィルターを回転カラムを使用するサンプルを集中し、4 ° C で保存

典型的な精製 (図 1) から始まるミトコンドリア小胞 (mitoplasts) 2 x 1011 procyclic に hypotonically 分離 1 x 1011からパーコールに分離された標準で培養したt. グリコシルホスファチジルイノシトールセル25グルコースが豊富な SDM 79 中27。スピン、超音波によって、mitoplasts が断片化しているし、行列を含む上清が破棄されます。ミトコンドリアの膜は F1をリリースするクロロホルムと扱われる-atp アーゼ。遠心分離の後有機相および析出中間期は破棄されます。水性相は強陰イオン交換器 (図 2 a) 第四級アンモニウム イオン交換クロマトグラフィーによる分画しました。主な溶出に対応する分数はピークし、F1を含む-atp アーゼがプールされて、集中しています。この材料は、秒、残留不純物を排除するために、入力として機能します。主要な汚染物質はジヒドロリポイル脱水素酵素、図 2 bに濃い緑のバーでマーク、離散ピークとして SEC カラムからた。F1-atp アーゼを示して最初の支配的な主に対称ピーク (図 2 b)。

浄化の進行状況は、BCA 蛋白質の試金 (または別の共通蛋白質の試金) 続いて、SDS-PAGE と ATPase 活性のモニタリングします。試金2, NADH の結合反応の吸光度の減少に基づいて再生成するプルマン ATP ATP 加水分解反応の速度を測定します。アジ化ナトリウム、F1の確立された抑制剤-F1の割合を決定する 2 mM 濃度の atp アーゼを使用-atp アーゼ-特定の ATP 加水分解。通常、入力の材料には、ミトコンドリア膜小胞のソースとして使用されているセルの数によって、ミトコンドリアのタンパク質の約 150-300 mg が含まれています。合計の ATPase 活性のアジ化敏感な割合はこの段階で約 30% から 40% です。クロロホルム抽出後サンプルの ATPase 活性の 90% 以上は1F に貢献-atp アーゼ。精製 F1- atp アーゼがアジ化治療 (最小限の残留 ATPase 背景 ATP 自己分解に起因する活動) にほぼ完全に敏感と 1 のおおよその収率と入力のタンパク質量の 1% の周りを表します -1.5 mg の F1-1 x 10 の11セル (表 1) あたり ATPase。分離精製 F1の後の典型的なバンド パターン-ATPase 染色ブルー続いて SDS ページのゲルには図 2に示すように。タンパク質は、ペプチド質量フィンガー プリントと様々 な質量分析アプローチ23詳しく特徴によって識別されました。散発的な弱いバンド β サブユニットのバンド上に見える α3β3 ♥ (二量体およびオリゴマーの α と β サブユニット) の subcomplexes を表し、任意の汚染物質を高感度質量分析による検出を欠いています。精製 F1-atp アーゼを保存ことができます数日室温で秒バッファー内に及ぶ。また、F1-atp アーゼ ≥2 mg/mL に濃縮することができます ph 8.0 に調節し、4 ° C で保存秒バッファー内飽和硫酸アンモニウムの等量によって投げ落とされる沈殿後少なくとも 6 ヶ月間、任意のサブユニットの明らかな劣化はありませんと活性酵素が秒バッファーまたは同様のソリューションで沈殿させた材料を redissolving で得られます。ただし、経験的に定められるように、1 ヶ月を超えるストレージは、結晶化適していません。

図 1: 精製法のスキーム。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: クロロホルム リリース F1の 2 段階精製-液体クロマトグラフィーによる atp アーゼ。(A) 陰イオン交換クロマトグラフィー (上部パネル) と選択した画分の溶出プロファイル Coomassie 青い色素 (下段) で染色 10%-20% トリス-グリシンの SDS ページのゲルの分離します。青のトレース: 紫外線吸光度 280 nm;赤のトレース: 溶出バッファー内の塩化ナトリウム濃度入力: F1-クロロホルムが発表した atp アーゼFT 通過。(B) 秒 (上部パネル) と選択した画分の溶出プロファイル Coomassie 青い色素 (下段) で染色 SDS ページのゲルの分離します。入力: プール F1を含む陰イオン交換クロマトグラフィーから分数-atp アーゼ。パネルAとBで色分けされたバーは、SDS-PAGE によって分析された溶出プロファイルで分数やそれぞれのジェルに対応するレーンをマークします。(C) 分離 F1の個々 の蛋白質のアイデンティティ-ATPase 質量分析によって識別されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: 典型的な進行状況と1F の収量の例-1 x 1011 procyclic t. 血細胞から分離したミトコンドリアから atp アーゼ浄化。

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