線虫の大規模な集団のハイスループット表現型解析を可能にする広い視野線虫追跡プラットフォーム (WF-NTP) を使用するプロトコルについて述べる。これらのプロトコルは突然変異系統または拡張性の高いファッションの薬理学的治療への反応の微妙な行動変化の特性評価に使用できます。
線虫は、生物医学研究、機能ゲノム学と老化研究で広く採用されている老舗動物モデルです。健康とフィットネスの調査の下で動物を評価するために 1 つは通常運動読み出し、体曲がりの数や動きの速度の測定などに依存します。これらの測定は通常手動カウントを含む、25 以下各実験での動物の数を制限時間として、良いの統計的有意性を取得し、制約の多い労働を困難に作る。努力が最近増加に焦点を当てて自動プロトコルを開発に加えられた高い統計的検出力は、再現可能な結果を取得し、弱い表現型効果を調査したときに偽の正と負の結果を制限する必要は、以来、パラメトリック最適化を用いた行動プロファイリング.運動検出感度遺伝学的研究と創薬の重要なことが多い小型の表現型の変化をキャプチャするために必要なレベルに検出限界を拡張するために述べるここまで 5,000 個々 の動物の研究を可能にする技術の開発同時に、による測定の統計的検出力を増加約 1,000 倍手動の試金に比較し、約 100 倍、その他の自動化された方法と比較しています。
約半世紀前、シドニー ・ ブレナーは開発とこの小さなとして、神経生物学を研究するモデル システムとして線虫(C. elegans) を導入 (1 mm の長さ)、透明な線虫は操作が容易です遺伝子研究室1を維持します。今日では、線虫アポトーシス、細胞シグナル伝達、細胞周期、遺伝子調節、代謝、自然老化2などの生物学的プロセスの様々 な研究に使用されます。さらに、線虫と高等生物 (ワーム遺伝子の 80% がある人間細胞)、間病経路の細胞およびティッシュの複雑な蛋白質の表現パターン省シンプルさとリンクと栽培の費用対効果は、生体内で効果的なモデル生物高スループット遺伝3,4,5,6,7、に従う8,9,10,11,12,13薬14,15,16上映。これらすべての理由から、線虫正常と病気関連の分子経路の特性評価に採用されています。神経変性のフィールド、たとえば、それが有効になってタンパク質凝集3,4,7,15,17の老化の影響の調査 18, とプロモーターの解析、タンパク質凝集3,4,5,6,7,14、阻害剤 18。
このタイプの調査で定義される重要な行動パラメーターであるみみずの全体的なフィットネスで測定できます手動でさまざまな方法でよう分 (BPM)4,6,ごと体曲がりの数を数える19、または運動20,21,22, の速度を測定することにより、平均寿命と麻痺の率を測定することによって。様々 な分子経路とメカニズム3,4,14,19、多くの重要な洞察をもたらした体曲がりの手動測定と運動の速度が 20,23, 手動の試金のまま現在低スループット、非常に手間と時間のかかるながらエラーや人間バイアスする傾向があります。これらの問題は微妙な行動の変化を区別するために十分な検定力とデータの収集にかなりの課題を提示します。この制限は、薬物分子が多い表現型変化の小さい24につながる潜在的な薬剤の処置としてスクリーニング、そのため再現性のある結果を得るために動物の多数の研究を必要とするために特に関連します。このポイントを示すためには、検出 (POD) の高出力動作に自信を持って重要な変更を定義して偽陽性の結果25を制限する必要がある最近の研究を示しています。手動カウント測定再現性、自動化、時間- とよりよい成果を交換する線虫のコミュニティで強い動機になりました。この需要を満たすためには、いくつかの研究所は最近高感度測定とワーム22,26,27,28 の大きい数の正確なワームの追跡の方法を開発しました。 ,29,30,31,32,33。
統計的に有意な測定に必要な動物の大規模なコホートにオートメーションのプロセスをさらに拡大、する追跡プラットフォーム (WF NTP)15,34 広い視野線虫を最近開発しました。、35,36, 非常に大規模なワーム個体群の複数表現型読み出し、統計的に関連する表現型検出25のキーファクターの同時調査を可能にします。WF NTP は現在並行して、最大 5,000 動物監視できますだけでなく、表現型の読み出しも体曲がり、動きの速度、麻痺は人口のごく一部の振幅率など、複数のパラメーターを含めると、動物のサイズ。したがって、容易に並列的多次元指紋36を作成する行動マップに別のリードアウトを結合するワームの何千もの画面に不可能です。関連付けられているオープン ソースのソフトウェアは、それを運用する必要がまた、完全にカスタマイズ可能な Python で書かれています。この技術を採用するユーザーを有効にするのには、グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) があります。
WF NTP の潜在的なアプリケーションのいくつかを示すプロトコルのシリーズを紹介します。特に、化合物、低分子化合物からタンパク質医薬品に至るまでの管理を議論し、小さなサンプルする必要性を効果的に除去するワームの大規模な集団に直接その効果を画面に説明サブ集団。WF NTP のような目的のための使用は、既にアルツハイマー病 (AD)15,34,35パーキンソン病 (PD)18 の創薬プログラムを設計する手順を目指したに重要な利点をもたらした治療候補35,37の評価のため体内のデータを使用しています。
光科学の分野の中で技術の急速に拡大のため、実質的に新しい方法で線虫研究における自動化された方法の要件に対応することが可能です今。その結果、追跡プラットフォーム20,41,42,43,44,45,46デジタルの数が設計されているし、上の利用可能手動カウントの曲げオメガ ターンなど寿命測定動作のより複雑な形態と同様、頻度、麻痺率、移動速度などのパラメーターを置き換えるために最後の数年間。最新自動化されたプラットフォームが大幅に再現性を向上して小さなコホート又はも個々 の動物で高品質なデータを提供線虫 c. エレガンスの感度41を研究します。我々 はワームの動作もできるように並列で動物の何千ものコホートの表現型を評価するための解析の自動化を拡張することを決めた。ワームのコホートの勉強のアプローチの主な利点、ワームの動作24の高い本質的な可変性および薬物治療の研究が多いが微妙なの表現型変化につながるという事実のための会計のこと動物の小さなグループを使用するとき十分な統計的に有意に検出することは困難。検出 (POD) のハイパワーは確かに必要な動作で自信を持って任意の有意な変化を検出し、偽陽性の結果25を制限します。
ここでは、一連のプロトコルはc. の elegans、追跡プラットフォーム (WF NTP)36広い視野線虫における最近報告された自動スクリーニング法に基づくを説明しました。ここで説明されているプロトコルは、5 つの部分に分かれています。パーツ 1 および 2 では、大規模なワーム個体群の準備について説明します。重要なステップは、労働条件の不稔と試薬や実験を実行に必要なプレートの準備です。私たちメモ、スクリーニング方法論36他と比較してこのプロトコルによって提供されるスループットの増加によりそれも必要があります増加された量の試薬;この要因は、実験的なデザインで慎重に検討する必要があります。健康的な幼虫がこれらの実験の実行に必要な漂白の手順が重要であり卵の数が多いと事前にテストが必要なをも注意してください。このプロトコルの第 3 部では、人口固体メディアと画面のワームに薬を届ける方法を説明します。我々 は、プロトコルのこの部分は数薬と並行してユーザーでテストする薬剤濃度に強く依存する注意してください。審査手続きと迅速なデータ取得の完全な自動化は、試薬調製と成長と大規模なワーム人口の同期に行動観察から制限ステップをシフトします。行動のスクリーニングの間に重要なステップは、録音や任意のワーム ステップ (例えば、追跡プラットフォームに NGM プレートからワームの転送) の処理のタイミングです。ここで説明されているプロトコルは 9 日まで大人の寿命中のワームを選別する設計例です。ただし、このプロトコルは、ユーザーの欲望、例えば、18 日間連続36多くの時間ポイントを画面に容易に適応することができます。その 4 上の線虫や部品 1-3 に示すプロトコル カスタマイズする方法簡単に、目的に応じてショーにタンパク質分子 (例えば、抗体と分子シャペロン) を提供するプロトコルのアプリケーションを示しています。アプリケーション。薬のような分子の分子シャペロンや抗体の37の管理の配信だけでなく、この手順を拡張する方法を紹介します。明記しない限り (パーツ) の最初の 4 つの手順は無菌状態下で行われます。液体のすべてのコンポーネントを使用する前にオートクレーブにする必要があり、70% の相対湿度でインキュベーション手順を実行する必要があります。第 5 部でトラッキングのステージとの組み合わせで提供されているソフトウェア パッケージを使用する方法をについて説明します。このソフトウェアのカスタムは大きなワーム個体群の挙動に関連する WF NTP データの分析のために設計されています。ユーザーがデータ分析のパート 5 で提供されるガイドラインに準拠するをお勧めしかし、これらのパラメーターが記録されたビデオ (すなわち、fps、視野、ビデオ解像度、取得したフレーム数) の特定の機能に依存しています。GUI で提供される関数の例は、分析の前に正しいパラメーターの評価を容易にするために設計されています。
これらの一連のプロトコルは、(現在まで並行 5,000 個々 ワーム) c. の elegansの大規模な集団の表現型を効果的に分析することが可能、動物の行動の本質的な可変性のための工芸品の削減, 線虫 c. エレガンス25の研究の統計的有意性を達成するために必要な検出力に関する予備的研究と一致しています。プラットフォームは、同時に複数の大規模なコホートを録画しながら高速で動物の大量の画像の記録が可能な高解像度カメラのシステムを使用します。高性能と WF NTP プロトコルのスループットは、非常に正確な方法でワームの動作の非常に小さな変化を確認することが可能になります。したがって、この方法論は、線虫の生物学の調査のためだけでなく、遺伝の修正と薬物の高スループット スクリーニングなどの薬理学的および医学研究のまた考慮する新しいアプローチトリートメント。この手順は、他の行動の測定と並行して、分子のスクリーニングの調査の主要な機能で実行する麻痺の研究を許可するという利点もあります。
広告15,34,35の PD18創薬プログラムでこれまでに達成されている結果が大幅に増加で広い視野のデータ集録の重要性を示す、単一の実験、実験誤差を減少させることにより、研究の統計的な妥当性が大幅に向上で監視できる動物の数。このプロトコルで記述されている現在のアプローチは、創薬の分野での課題を解決することに焦点を当て、我々 は方法論が社会で広く採用されるが、複雑な遺伝の応用、拡張することを願って、行動の研究が現在検出可能な表現型の数を増やすと。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、フォールディング病 (CMD) の中心によって支えられました。FAA は、アルツハイマー病の社会、イギリス (許可番号 317 AS-SF-16-003) から上級研究員賞を受賞しています。線虫の系統は、線虫遺伝子センター (CGC) から得られました。
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |