ゼブラフィッシュは、光学的透明度、急速な外部の開発を含む多くの貴重な機能を持ち、聴力と平衡感覚のフィールドに、特定の重要な感覚の有毛細胞に位置する外部モデル システムです。この資料について説明どのようにトランスジェニックゼブラフィッシュ トトで有毛細胞の形づくりとシナプス前機能の両方を試金するため使用することができます。
有毛細胞の感覚は、内耳の聴力と平衡感覚に必要な受容です。有毛細胞は、機械的に髪束と呼ばれる根尖部の突起をそらす感覚刺激への応答でアクティブ化されます。たわみは、カルシウムを含む陽イオンの流入につながる髪束のメカノトランスダクション (MET) チャンネルを開けます。この陽イオンの流入はセルを脱分極し、有毛細胞のシナプスにおいて基肥に位置する電位依存性カルシウム チャネルを開きます。哺乳類で、有毛細胞、骨に収められて、機能的に生体内でこれらの活動を評価するために困難です。対照的に、ゼブラフィッシュ稚魚は透過的であり、有毛細胞を含む外部に配置されて – 側線器官を所有しています。これらの有毛細胞は哺乳類の有毛細胞に機能的、構造的に類似しているし、機能的生体内で評価することができます。ゼブラフィッシュ側線有毛細胞の信号刺激誘発カルシウムを測定する GCaMP6s の遺伝的コード化カルシウム インジケーター (GECI) を利用する方法を説明します。GCaMP6s 使用できます、共焦点イメージングと一緒に頂点で横ラインの有毛細胞の生体内でのカルシウム信号を測定します。これらの信号は、これらの有毛細胞内カルシウム活動を長らく謎とシナプスに依存両方リアルタイムで定量化可能な読み出しを提供します。これらのカルシウム信号も有毛細胞を検出し、感覚的な刺激を送信する方法に関する重要な機能情報を提供します。この手法がカルシウム活動の相対的変化について有用なデータを生成します全体的に、生体内で。カルシウム変化の絶対的な大きさの定量化はあまり適してです。この生体内の技法は、体動に敏感です。適度な練習と能力が必要適切な位置、固定、および幼虫の刺激です。最終的には、正しく実行されると、この資料で説明されているプロトコルは生きている動物内の自然な完全に統合された状態で有毛細胞の活動に関する貴重な情報を収集するために強力な方法を提供します。
機能カルシウム イメージングは、多くの活動を監視するための強力なツール細胞同時に1です。特に、遺伝的コード化カルシウム指示薬 (GECIs) を用いたカルシウム イメージング GECIs が特定の細胞型で表現できる、ローカライズ subcellularly2ので有利である示されています。神経科学研究では、これらの機能したカルシウム イメージング GECIs 両方神経回路網内の活動のパターンを定義し、個々 のシナプス3,4カルシウム流入を測定する強力な方法。これらの機能を活かし、最近の研究は感覚毛の細胞5のコレクション内で細胞の活動を監視する共焦点顕微鏡と GECIs が使用されます。
有毛細胞は、内耳とローカル水の動きで水生 vetebrates6、7の横ライン システムでサウンドと前庭刺激を検出するメカノレセプターです。有毛細胞の損傷や感音性難聴の損失8,9として知られている人間の難聴の最も一般的な形式は、遺伝子の突然変異のターゲットが多い。したがって、治療や難聴を予防する方法を理解するためにどのようにこれらの細胞の機能を理解する重要です。正しく機能するには、有毛細胞利用機械刺激受容髪束と検出し、それぞれの刺激を伝達するシナプス リボンと呼ばれる 2 つの特殊な構造です。髪束は有毛細胞の頂点にあり、不動 (図 1A) として知られている、毛のような突起から主に成っています。前庭と横ラインの有毛細胞の各毛束があります、単一長い運動毛 (セルの唯一の真の繊毛)、不動 (図 1A) 上記まで拡張することができます。機械刺激受容刺激髪束をそらすため、たわみが連携「先端リンク「不動10を相互接続すると呼ばれる緊張を置きます。この緊張感は、陽イオン、カルシウム11,12を含む腔流入の結果、不動である明らかでない (MET) チャンネルを開けます。この根尖部の活動は最終的に有毛細胞を脱分極し、電位依存性カルシウム チャネル (Cav1.3) セルの基地でを開きます。Cav1.3 チャネルがシナプス リボン、テザーにアクティブなゾーンで小胞シナプス構造に隣接してあります。Cav1.3 チャネルを介して基底のカルシウム流入は求心性ニューロン13,14の活性化、神経伝達、小胞融合に必要です。
長年にわたり全細胞パッチクなどの電気生理学的手法は、ゼブラフィッシュ15,16,17,を含む多くの種の有毛細胞の機能特性をプローブに使用されている18,,1920。これらの電気生理学的記録は聴力と平衡感覚のフィールドで特に貴重なされている上非常に高速の刺激をエンコードすることを目的、個々 の感覚的な細胞から非常に敏感な測定値を得ることができるため、周波数と強度21,22の広い範囲。残念ながら、全セルの録音は、有毛細胞の集団の活動を測定できません。ゼブラフィッシュの側線で細胞の集団の活動を研究するには、スペクトラムの電位と求心性活動電位を合計機械受容と個々 のオイカワ23 のシナプス応答特性を測定する使用されています。 ,24。残念ながら、全セルの録音もローカル フィールド電位測定は、特定活動が個々 の細胞内で発生する、または、人口内の各セルの活性を測定する空間解像度を持っています。最近では、カルシウム染料と GECIs これら課題25,26をバイパスするために採用されています。
ゼブラフィッシュ GECIs トランスジェニックゼブラフィッシュと幼虫27の光学的透明度を作成する相対的な容易さのための有毛細胞の機能を検査する強力なアプローチであると証明しました。ゼブラフィッシュ幼虫で横ライン システムと同様に、内耳の有毛細胞があります。側線はロゼットのようなクラスターの有毛細胞の水の動き (図 1) のローカルの変更を検出するために使用、オイカワと呼ばれる成っています。側線は魚の表面に沿って外部にあるため便利です。このアクセスは、有毛細胞を刺激し、そのまま幼虫における光学的カルシウム信号を計測可能になりました。全体的に、遺伝子導入、幼虫の透明性と横ラインの有毛細胞の比類のないアクセスの容易さが有毛細胞の生体内での活動を研究する非常に貴重なモデル ゼブラフィッシュを作った。これは、有毛細胞が内耳の骨構造に囲まれている哺乳類のシステムと比較して重要な利点です。アクセスのこの欠乏は、哺乳類の有毛細胞の機能の in vivo 測定を取得する非常に困難になっています。
ここで説明したプロトコルでは、MET ゼブラフィッシュ稚魚におけるオイカワ内のセルの間で個々 の有毛細胞内のカルシウム チャネル、シナプス依存変化を監視する方法について説明します。このプロトコルは、有毛細胞の特定のmyosin6bプロモーター28の制御の下で膜のローカライズされた GCaMP6s を表す確立したトランスジェニックゼブラフィッシュ線を利用しています。この膜のローカリゼーションは、有毛細胞機能にとって重要な細胞膜にあるイオン チャネルを介してカルシウム流入を検出する GCaMP6s を配置します。たとえば、GCaMP6s の膜局在がカルシウムを検出できます MET を通じて流入チャンネル頂髪束および CaVセルの基地でのシナプス リボン近く 1.3 チャンネル。これは細胞質に局在 GECIs を使用してゾル性細胞質 GECIs が他のソースからのカルシウムの貢献と同様、MET と Ca のV1.3 チャネル活動の組み合わせをしているカルシウム信号を検出と対照的 (例えば、ストアのリリース)。このプロトコルでは、固定し、イメージ作成前 GCaMP6s トランスジェニック幼虫を麻痺させる方法について説明します。その後、準備および制御で再現可能な方法で横ラインの有毛細胞を刺激するために髪の束をそらすために流体ジェットを使用する方法について説明します。このプロトコルを使用して達成することができる代表的なデータが掲載されています。運動の成果物を表すデータの紹介も。結果を確認し、成果物を除外する使用される制御実験を説明しています。最後に、フィジー ソフトウェアにおける空間カルシウム シグナルを可視化する方法を説明します。このフィジーの解析が MATLAB5を使用して以前に確立された可視化手法から適応です。全体的に、このプロトコルは、ゼブラフィッシュ稚魚の GECIs を使用して計測し、生体内の有毛細胞のカルシウム動態を可視化する強力な手法を説明します。
そのまま動物の生体内イメージングは本質的に困難です。この方法のいくつかの手順は、信頼性の高い体内側線有毛細胞からのカルシウム測定値を得る重要なです。たとえば、幼虫を固定するか、イメージング画像中の動きを最小限にする前に適切に麻痺して、非常に重要です。真の信号ではなく、カルシウム レベルの変化に対応していない GCaMP6s 蛍光イメージング中に過剰な運動できます変更につながる (例えば、数字・ 4b1 型 ‘-B1’と4 C 1′ C1 ‘)。これより後方のオイカワにアクセスできなく可能性があります、動きを最小限に抑えるために、前方から詳細尾ピンを配置できます。さらに、心臓注入後ピンを回転ピンの水平部分の向こう、卵黄、できます。ピンの位置の変更、に加えてそれはまた幼虫34を固定するピンの代わりに脳スライスのハープを使用することが可能。幼虫を適切に配置するハープが追加、潜在的に幼虫を固定の侵襲的な方法以下です。重要な動きは不十分な固定から発生する可能性、α-ブンガロトキシン部位を提供し幼虫を麻痺させる心注入を正しく実行する失敗が不完全な麻痺、運動で起因し、最終的に成果物を運動します。ゼブラフィッシュの有毛細胞の興奮性に影響を与える一般的に使用される麻酔薬が示されているが、最近の仕事は麻酔ベンゾカインが有毛細胞の活動の多くの側面に干渉しないを示しています。同様に、よく使われる麻酔薬 MS 222 有毛細胞活動15の特定の側面と干渉します。したがって、α-ブンガロトキシン部位注入の挑戦的な性質のためベンゾカインまたは MS 222 アプリケーションになるかもしれない機能カルシウム イメージング中に幼虫の動きを防ぐために麻痺の有用な代替方法です。
このプロトコルに関連する技術的な課題に加えても完全にマウントされたサンプルは幼虫と有毛細胞は、前に、各イメージング実験中に健康ではない場合は無意味です。幼虫と有毛細胞が正常であることを確認、絨毛 (卵の殻)、廃棄物、微生物などの破片の自由である E3 バッファーの幼虫が維持されていることが重要です。横ラインの有毛細胞の表面的な位置はイメージングのため有利であるが、この場所それらが細胞の損傷を受けやすい場合 E3 バッファーをファウルします。きれいな水環境が若齢幼虫 (2-4 dpf) にとって特に重要なまたは直立したスイミングを維持できない変異体を置き、主にペトリ皿の底に横たわる。これらの状況で、横ラインの有毛細胞と髪束を囲む保護クプラ簡単に妥協になることができます。健康的な幼虫と各実験の過程での有毛細胞で始まる場合でも、幼虫がハートビートおよび急速な血流であることを確認する重要です。血流が低下または停止する有毛細胞の健康が危険にさらさなっています。不健康な幼虫や血流の損失を含む妥協の準備、有毛細胞を死を識別するいくつかの方法: まず、病変が拡がったまたは DIC 光学素子の下のセル内のバブルとして現れる核凝縮の出現によって第二に、セルの縮小と高速移動; 細胞質内粒子の存在でそして第三に、kinocilia のヒントが異なる方向35で腰掛けるとき。、毛束が中断されたとき、スプレイ kinocilia が刺激の中にまとめて一緒に移動しません。
この準備は、1 つは、準備だけが堅調が確立された後の 1-3 時間のいくつかのマイナーな制限をしています。幼虫を動けなくハープの小さいピンまたは脳スライスを使用してなどの変更とこの体内準備の有効期限の延長が灌流システムを追加します。別の制限は、退色、光毒性は、イメージング試験を繰り返した後に発生する可能性が。このような課題を克服するために 1 つのエキサイティングな方法は、光シート顕微鏡のこのプロトコルを適応することです。光シート顕微鏡は、36以下の退色、光毒性につながる焦点光を軽減する強力な方法です。一緒に、穏やかな固定化と以下の写真の露出を助けるかもしれない各撮像セッションを延長します。もはやイメージング セッションを使用して、開発および基本的な有毛細胞のクリアランスと損傷後の再生プロセスに伴う機能変化の全期間を確認できます。それは、光シート顕微鏡に加えてこのプロトコルに適合できる他型共焦点システム (ポイントのスキャン、2 光子とスピニング ディスク) だけでなく、比較的簡単な広視野システム28,34 を指摘することが重要.全体的にみて、その多様性は、このプロトコルの適応および複数の撮像システムで使用できる貴重なツールになります。
このプロトコルの適応および多くのイメージング システムを使用できますが、このプロトコルの部分も適応し、(1) GCaMP6s のほか、(2) 他の感覚的な細胞およびゼブラフィッシュ稚魚内のニューロンのイメージ活動に、他のインジケーターと共に使用できます。たとえば、以前の研究では、膜、膜電位 (Bongwoori)、小胞の融合 (SypHy) ゾル性細胞質カルシウム (RGECO1) を検出する側線有毛細胞内複数の遺伝的コード化の指標を使用してイメージの活動にこのプロトコルが使用(jRCaMP1a ・ カァシュと GCaMP6s ・ カァシュ) カルシウムと膜カルシウム (GCaMP6s ・ カァシュ)5を検出する側線求心性プロセス内で。これらの指標を使用して我々 の経験に基づいて、Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) はこのプロトコルで記述されている形質転換線は側線オイカワのイメージングのための素晴らしいスタートをご利用いただけます。すべての指標は、上記の我々 は GCaMP6s が最も敏感なあることを発見しました。2 つの測定値に使用できるため、これらの機能に加えて、我々 は Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) トランスジェニック行を強調表示: 有毛細胞の形づくりとトランスジェニック一行内のシナプス前のカルシウム。
この資料に記載されているテクニックは、ゼブラフィッシュの側線でカルシウム イメージングがネイティブな環境で有毛細胞がどの機能を研究する強力な方法をすることができますどのようにについて説明します。このアプローチは、有毛細胞の機能がex vivo植で勉強現在の哺乳類の研究を補完するものです。さらに、ゼブラフィッシュ モデルは哺乳類の有毛細胞の活動を調べるに適用することができます遺伝的コード化の指標の有効性をテストするためのプラットフォームとして使用する続行できます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、NIH/NIDCD 学内研究資金 1ZIADC000085-01 (K.S.K.) によって支えられました。フィジー マクロを記述で彼女の援助のキャンディ ウォンを認識したいと思います。プロトコルとその有用な提案のドリス ・呉とキャンディ ・ ウォンに感謝したいと思いますも。
Section 1 | |||
α-Bungarotoxin | R&D Systems | 2133 | For paralyzing larvae prior to imaging |
Phenol red Solution 0.5% | Sigma-Aldrich | P0290 | For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing larvae |
Section 2 | |||
Imaging chamber | Siskiyou | PC-R | Platform to mount larvae for imaging |
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm | VWR | 48366-227 | To seal imaging chamber |
High vacuum silicone grease | Fischer Scientific | 14-635-5D | For affixing of coverslip to imaging chamber |
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit | Ellsworth Adhesives | Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | To fill imaging chamber to create a surface to pin fish |
Oven | Techne | HB-1D | For drying silicone encapsulant |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating wire, forceps and scissors to make pins |
Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For making pins |
Fine scissors | Cole-Palmer | 5.5", EW-10818-00 | For cutting tunsgten wire to make pins |
Tungsten wire, 0.035 mm | Goodfellow | W005131 | For head pins to immobilize larvae |
Tungsten wire, 0.025 mm | ThermoFischer Scientific | AA10405-H4 | For tail pins to immobilize larvae |
Section 3 | |||
Micropipette guller | Sutter Instrument Company | P-97 | For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles |
Borosilicate glass capillaries w/ filament | Sutter Instrument Company | BF 150-86-10 | Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection |
Borosilicate glass capillaries w/o filament | Sutter Instrument Company | B 150-86-10 | Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells |
Pipette polisher | Narishige | MF-830 microforge | To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks |
Ceramic tile | Sutter Instrument Company | NC9569052 | For scoring and evening breaking fluid-jet needles |
Sections 4 & 5 | |||
Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For pinning larvae |
Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling heart injection needles |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating larvae during pinning and heart injection |
Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection |
Pressure injector | Eppendorf | Femtojet 4x | To deliver α-bungarotoxin |
Sections 6, 7 & 8 | |||
Confocal microscope | Bruker | Swept field/Opterra confocal microscope | Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters |
Microscope software | Bruker | Prairieview 5.3 | To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet |
10X air objective | Nikon | MRH00101 | Low magnification for positioning of larvae and fluid jet |
60X water objective | Nikon | MRF07620 | Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm) |
Piezo-Z objective scanner with controller/driver | Physik Intruments instruments/Bruker | 01144210/UM-Z-PZ | High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy |
EMCCD camera | QImaging | Rolera EM-C2 EMCCD camera | Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s |
Circular chamber adapter | Siskiyou | PC-A | For holding and rotating imaging chamber on microscope stage |
Motorized Z-deck stage | Prior Scientific | ZDN12MP | Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together |
Z-deck stage insert adaptor | NIH Machine shop | custom | To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage |
Fluid-jet apparatus | ALA scientific instruments | HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP | For controlling and delivering the fluid-jet stimulus |
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft) | Cole-Palmer | Masterflex L/S 13, 96400-13 | For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump |
Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Company | MP-225 | For holding and positioning of needle holder for fluid jet |
Micromanipulator controller | Sutter Instrument Company | MPC-200 | For controlling fluid-jet needle manipulator |
Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling fluid-jet needles |
Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
PSI manometer | Sper Scientific | 840081 | For measuring pressure clamp output |
Section 9 | |||
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant | ThermoFischer Scientific | B1204 | To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals |
Isradipine | Sigma-Aldrich | I6658 | To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Solvent for pharmacological compounds |
Section 10 | |||
Prism7 | Graphpad | Prism7 | Software to plot GCaMP6 intensity changes |
FIJI | Schindelin, et., al.34 | https://fiji.sc/ | Software to process images and create spatio-temporal signal maps |
Turboreg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
StackReg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
Times Series Analyzer V3 Plugin | Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html | Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes |