ここでは、デザインし、神経成長因子 (NGF) の分解性キャリアとしてポーラス シリコン (PSi) 膜のナノ構造を作製するためのプロトコルを提案する.神経分化・ PC12 細胞およびマウス後根神経節 (DRG) ニューロンの伸長は PSi の NGF ロード キャリアと特徴付けられます。
偉大な可能性にもかかわらず NGF の神経変性疾患の治療のため、その治療的投与はタンパク質化学的性質のため、血液脳関門を通過しないと重要な挑戦を表すし、長期を必要と生物学的効果を持っている脳へ配信。この作品では、このタンパク質の機密性の高い持続的なデリバリーに NGF の分解性キャリアとしてナノ構造 PSi 薄膜の作製について説明します。PSi のキャリアはその生物学的活性を維持しながら、4 週間の期間の高荷重効果および NGF の連続リリースを入手に合わせて。NGF 配信システムとして NGF PSi キャリアの動作は、神経細胞の分化と解離 DRG ニューロンと PC12 細胞の伸長を誘発する能力を調べることによって生体外で調査です。きちんとした、NGF ロードの PSi キャリアの存在下での細胞生存率が評価されます。PSi のキャリアからリリースされた NGF の生理活性は、反復的な無料 NGF 行政の従来の治療法と比較されます。PC12 細胞分化を分析し、差別化されたセルの 3 種類の形態学的パラメーターの測定によって特徴づけられる(i) (ii) の合計の突起の長さ、(iii) 分岐ポイントの数、相馬から抽出神経突起の数。PC12 細胞の NGF PSi キャリアで治療はリリース期間中の深遠な分化を示しています。また、NGF PSi キャリアと培養後根神経節神経細胞は、繰り返し無料 NGF 政権とニューロンのよう扱われる広範な神経突起形成開始を見る。勉強の可変キャリアを示す神経変性疾患の治療の可能性と NGF リリースの長期的なインプラント。
NGF は、開発や末梢神経系 (PNS)1のニューロンのメンテナンスのため不可欠ですし、中枢神経系 (CNS)2の生存と前脳基底部コリン作動性ニューロンの機能に重要な役割を果たしています。中央の神経変性疾患、アルツハイマー病やパーキンソン病などの治療に可能性が高いその薬理学的実証されている広く、進捗状況3,4,5、現在の臨床試験で 6。中枢神経系への NGF の配信の最大の課題は (BBB)、全身投与7血液脳関門を通過できないことに存在します。さらに、急速な酵素分解する NGF 感受性はその短いによるハーフライフをレンダリングし、その治療上の使用8,9が大幅に制限します。したがって、安全に NGF のリリースが長引くと制御を可能にする配信システムの設計が満たされていない課題があります。ポリマー ベースのシステムを含む各種の NGF 配信システムは,10,11,12,13,14,15,をされています。16,17. これらのシステムのリリースのプロファイルが、後者の段階に解放率は初期バースト11 と比較して大幅に低低速連続リリースに続いての最初のバーストによってしばしば特徴づけられる、18,19。さらに、このシステム20封止工程 (例えばpoly(lactic-co-glycolic) 酸) 高分子酸性分解産物や NGF 活性の損失による蛋白質の不活性化が観察されました。
ナノ構造 PSi は有望な薬物配信プラットフォーム21、predestining、体液で高表面積、大量多孔性、生体適合性、可変分解を含むいくつかの魅力的なプロパティによって特徴付けられる 22,23,24,25,26,,2728。陽極酸化条件の適切な選択は薬物読み込みとリリース速度21,27仕立ての PSi 構造特性 (例えば、気孔率と気孔サイズ) を簡単に調整することができます。また、様々 な便利な化学ルート PSi の表面を変更し、そのことによって生理学的条件下での Si 足場の溶解速度と薬22,24の解放率をさらに調整することができます。 29,30。
この作品は、NGF の長期徐放の PSi に基づく配信システムの設計について説明します。神経細胞の分化と伸長に及ぼす NGF PSi キャリア PC12 細胞を用いて、DRG ニューロンを分離しました。読み込まれた NGF が神経突起伸展と単一管理内で 1 ヶ月リリース期間中の深遠な分化を誘導することによってその活性を保持することを示す.
問題高等2分解性ナノ薄膜を作製し、神経成長因子、生理活性を維持しながら、継続的かつ長期にわたるリリースを可能にするためのキャリアとして採用します。NGF の配信システムとして問題高等2の可能性は、神経細胞の分化を誘導し、DRG ニューロンと PC12 細胞の伸長を促進する十分な用量で NGF を解放する能力を示すことにより体外で実証。設計された映画は、今後の治療で体内の NGF の長期貯蔵庫として使用できます。
捏造の PSi 薄膜の構造特性が NGF ペイロードに特化しました。電気化学エッチング過程の電流密度は、約 40 の気孔のサイズを取得する調整された簡単に NGF、26.5 kDa32のポリエチレング33~ 4 nm の特徴的な直径とタンパク質を収容する nm多孔質マトリックス内また、多孔質足場材料の熱酸化は、正荷電荷電酸化 PSi 表面蛋白質の静電引力により NGF の物理吸着を有効にするため行われました。PSi の表面化学は読み込みの有効性に大きな影響を及ぼすし、ペイロードと多孔性のマトリックスの相互作用を適切に制御するために簡単に調整できます。その後、これらの相互作用は、吸着タンパク質分子の構造とその生理活性34,35,36を指示します。結論としては、システムが適切な細孔径、表面特性と理想的な載荷溶媒とパラメーターを述べた指示の結果の効果の蛋白質のローディングを慎重に選んで NGF の最適な読み込みを取得する調整されました。効果。したがって、界面化学、作製パラメーター (例えば、電流密度、エッチング時間、型、ドーパントや電解質の濃度) の変化またはローディング効果と生物活性に影響を与えることができます溶液組成を読み込み、読み込まれているタンパク質です。
PSi orPSiO2ホストからペイロードの解放率は、一般的に 2 つの同時のメカニズム、ペイロード分子の拡散と Si 足場37の劣化の組み合わせによって決まります。侵食とその後の溶解速度を注入サイト、その病理と病の状態28,38,39で受けます。異なるリリース速度は、特定の治療上の適用の必要がある場合リリース プロファイルできます変更、PSi 表面38,40、表面の化学を変更することによって延長前の仕事に設立 41。熱酸化、熱炭化ヒドロシリル化技術などの種々 の化学修飾は、PSi の表面を安定させ、その劣化と結果としてペイロード リリース35,42 に影響に示されています。 ,,4344,45。また、共有結合が壊れたときにだけペイロードが解放されるのでより長期のリリースで様々 な表面の化学経路を介して Si 足場に蛋白質分子の共有結合によってキャリアへの NGF の読み込みがありますかマトリックスは、Si をサポート21をが低下。
さらに、その作製プロセスに従って PSi に表示できる薄膜、微粒子46、ナノ粒子47フリースタンディング膜26、キャリアとしても使用できるなどのほかさまざまな構成NGF と満たす特定のアプリケーション ニーズ.
臨床的に関連するために、問題高等2キャリア内 ngf 治療用量の範囲に到達する必要があります。携帯メディアの 2 mL の一貫性のあるボリュームにプロトコルで説明されているメソッドで NGF ロード問題高等2キャリアの導入や PBS バッファーとしたがって、読み込みソリューションと読み込まれたそれぞれの NGF 質量濃度の調整をもたらすをテスト生体外でシステムに関連した NGF 濃度をリリースしました。体外か体内環境などさまざまなシステムのこのメソッドを活用したソリューションを読み込み NGF 濃度増加なり必要な量に応じて調整。また、NGF 含量はテスト面積あたり複数の搬送波を導入または問題高等2サンプルの大きい区域を使用して取得できます。
また、リリース期間に沿って時点以降にリリースされた NGF 濃度が以前の時点よりもはるかに低いに注意してください。時間の経過とともに NGF 磁束が一定ではないという事実は、アプリケーションのニーズに合わせてシステムを設計考慮したする必要があります。
多数 NGF 配信システムが開発され、ポリマー ベースのシステムは、報告は本邦では、それらのほとんどは10、11,12,15抱合体合成又は天然の高分子から成る,16,17します。 これらのシステムは、効果的な示されている徐放性プロファイル、しかし、重要なバーストの効果で数日にわたってスパン リリース期間。これらの配信プラットフォームのいくつかの異なる安定剤18,48, 洗練された、複雑な使い方が必要な封止工程時に生物活性の損失などクリティカルな制限に苦しむ作製テクニック16。蛋白質のための配信システムの設計における最大の課題の 1 つはキャリア システムの内でわなに掛ける事によって分子の生理活性を維持する能力です。タンパク質、ペプチドは、両方の重要な要因は、これらの敏感な生体分子を読み込みとき強いの有機溶剤を使用せずに PSi/問題高等2常温または低温でもロードできます。以前の研究では、PSi/問題高等2表面化が読み込まれた蛋白質35,36の可能な変性を最小限に抑える重要な役割を果たしていることを示しています。したがって、PSi/問題高等2は特に一般に成長因子のための配信システムの開発と NGF の有利なナノ材料です。
現在の仕事は CNS 神経変性疾患の潜在的な治療のために NGF の直接投与の治療法として本法を活用に焦点を当てた。NGF ロード問題高等2キャリアは、マウスの脳に埋め込むことができる、長期的なインプラントとしてプラットフォームの有効性は,生体内で。さらに、この有望なキャリアを組み合わせて非侵襲的上49,50可能性があります 1 つ有効に空気圧を用いたローカライズされた領域に高い空間分解能で NGF ロード問題高等2粒子を管理するため時空間の投薬が必要な神経変性疾患の治療のためのキャピラリー銃。また、NGF は化学勾配方法51、軸索ガイダンス分子のように神経細胞の成長を指示できます。したがって、ロード問題高等2キャリアは、神経成長因子、成長、他演出キュー52,53を補完する誘引のホット スポットとして使用できます。さらに、さらにチューニング問題高等2ナノ構造とその表面の化学多く拡張期間の数ヶ月までの NGF の配信を維持するために問題高等2キャリアを具体的にカスタマイズできます。
The authors have nothing to disclose.
MS と ES コア サービスを認めるし、生命科学、工学およびテクニオン ラッセル ベリー ナノテクノロジー研究所の金融支援トラック i. ローキー センターからサポートします。
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |