概要

初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイド ホルモン産生機能の試金

Published: March 12, 2019
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概要

副腎皮質から分泌されるホルモンは、ストレスや病気に対して動物に不可欠です。ここでは、プライマリのラットの文化にプロトコル副腎細胞を提案します。副腎ステロイド生合成機能と脂質生合成に興味の試薬のメカニズムを調査するための良い生体外のプラットフォームかもしれない。

Abstract

副腎皮質が分泌するホルモンは、ストレスや病気に対して動物に不可欠です。ここで説明する方法は、初代培養ラット副腎細胞および関連機能アッセイ (コルチコステロンの分析と同様、脂質液滴表面蛋白質の蛍光抗体染色) の手順です。体内のモデルとは異なり副腎単層培養で interexperiments のバリエーションが少なく、実験条件がコントロールしやすい。その上、ラットのソースは牛のもののような他の動物よりも安定も。副腎研究で使用することができますいくつかのひと副腎細胞株 (NCI H295、NCI H295R、SW13 等) もあります。ただし、これらの行のステロイドの生産は血清のロット番号、通路番号、個別の遺伝子などの変異/損失を含む多数の要因によっては影響も。17 α-ヒドロキシラーゼを欠けているを除いてラット副腎皮質細胞の初代培養は副腎の生理学を研究のためのより良いより便利な技術です。要約すると、初代ラット副腎文化副腎システムに関心の試薬のメカニズム解明のための研究者の良い体外プラットフォームとなる可能性があります。

Introduction

内分泌系は生理学的な活動と恒常性1の調節を担当です。腎臓の頭蓋の極に位置する副腎、ミネラルコルチコイド、糖質コルチコイド、アンドロゲン2,3を分泌する主な内分泌器官の一つです。副腎の 2 つの部品がある: 皮質と髄質。副腎皮質は 3 層で構成されています: 外側の球状、中間皮質および内部の斑3。球状はアルドステロン、ナトリウム イオンと3腎臓の水再吸収を助ける鉱質コルチコイドの分泌元のサイトです。ゾナ副腎皮質は主に通常の生理条件3のグルココルチコイドの基底レベルを生成します。齧歯動物の副腎皮質ステロイドと人間のコルチゾール血ブドウ糖3を調節することによってストレスに対処で体を支援するために行動します。ある程度、炎症反応を抑制する、免疫システム4,5を規制できます。他の哺乳類、マウス、ラットと対照をなして副腎67の 17 α-ヒドロキシラーゼ式の不足のための機能的な網状を必要はありません。したがって、マウスおよびラットの副腎、副腎の C-19 ステロイド (コルチゾール、副腎男性ホルモン) の分泌を欠いています。

副腎皮質培養細胞副腎生理8を制御するメカニズムを調査するために有用であることが示されています。他のステロイド ホルモン産生組織のような各副腎ゾーンは遊離型コレステロール9からそのステロイドを合成します。刺激による副腎皮質刺激ホルモン (ACTH)、遊離コレステロールは内訳脂質液滴から解放され、したがって、副腎皮質、皮斑10でステロイドの産生を促進します。

多くのグループは、副腎皮質癌から安定したセルラインを確立しようとしています。ただし、いくつかの懸念には、副腎皮質細胞の生体外モデル8のように使用が限られています。細胞のステロイドの応答は通路、血清のロット番号と血清等の品質が異なる場合があります。さらに、商業の副腎細胞株 (Y1 と SW13) は副腎ステロイド生合成の8を研究することが難しく、コルチコステロンを分泌しません。前のヴィヴォ モデルは良い選択をすることができるこれらの市場からの組織は、いくつかの未知のリスクをぼやける場合がありますにもかかわらず、牛と馬の副腎を使用してください。それらに比べると、ラット副腎の管理が簡単で、ソースが比較的安定していてより病原体フリーします。一緒に取られて、ここで説明した本法は、ラット副腎皮質細胞におけるコルチコステロン合成の関連のメカニズムを調査する使用できます。

Protocol

動物科目を含むすべてのプロシージャは、制度的動物のケアと使用高雄医科大学委員会によって承認されています。 1. 実験手順 CO2安楽死によって大人 (12 週齢に 8) 女性/男性 SD ラットを犠牲に。 70% エタノールを適用させ、皮膚に吸収されると、その後、ティッシュ ペーパーで拭き取る。 ラットを仰臥位できれいなプラスチック プレート?…

Representative Results

ここで説明する手順を使用して、(図 1 a) 位相差顕微鏡下で培養副腎細胞を識別できた。脂質を細胞質内小胞に、ことを確認、脂肪分化関連蛋白質 (ADRP) の免疫組織染色法は (図 1 b) 一日 3 文化の実施でした。セルはガラス coverslips に育った。セルは、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 3 回を洗浄され、4% パラホルムアルデヒド?…

Discussion

副腎は、環境適応3で重要な役割を再生します。副腎皮質が分泌するホルモンは、規制し、生理機能と恒常性3を調整できます。生体内でのモデルには、体の本当の生理効果が反映されます。しかし、それはまだ実験で不安定な影響を引き起こしている多くの複雑な要因に影響されます。対照的に、培養細胞モデルでは利点がある動物モデルに比類のないに?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、国家科学審議会台湾 (NSC102-2320-B-037-008-MY3) と国立チェン Kung 大学病院研究助成 (NCKUH-10102045) からの助成金によって支えられました。

Materials

female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk) BioLASCO male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments
collagenase, type II Sigma C-6885 isolation of adrenal cells
DMEM ThermoFisher 12800-017 powder media for adrenal cells
Ham's F12 ThermoFisher 21700-075 powder media for adrenal cells
HEPES JT.baker 4018 buffer (powder)
NaHCO3 JT.baker 3506-1
Horse serum Hyclone 16050014
Fetal bovine serum SAFC 12103C
penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml) Corning 30-002-Cl antibiotics
curved forceps BRAUN BD343R
forceps BRAUN BD331R
scissor BRAUN BC224R cut rat skin and muscle
delicate scissor BRAUN BC101R cut adrenal glands
adipose-differentiation related protein Abcam ab108323 antibody for lipid droplet associated protein
corticosterone ELISA kit cayman 500655 assay for corticosterone synthesis
inverted light microscopy Leica
fluorescence microscope Nikon
Triton X-100 JT.baker X198-07 for immunofluorescence staining
goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody ThermoFisher A-11034 for immunofluorescence staining
anti-ADFP Abcam 108323 for immunofluorescence staining
ProLong Gold antifade mountant ThermoFisher P36935 for immunofluorescence staining

参考文献

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記事を引用
Chen, Y., Huang, B. Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions. J. Vis. Exp. (145), e59016, doi:10.3791/59016 (2019).

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