概要

真似をして 3次元細胞培養の膵腺房の上皮化生を操作します。

Published: February 11, 2019
doi:

概要

原発の腺房細胞分離、蛋白質の表現や活動の変調、文化、およびダウン ストリーム アプリケーションは ex の豊富有用腺房の上皮化生 (ADM)、膵臓癌の開発の初期イベントに関する検討。

Abstract

膵炎と膵臓癌の開発の初期に腺房細胞の上皮細胞への分化は、さらなる研究を必要とする重要なプロセスです。メカニズムを理解するには、ex vivo 3次元培養とプライマリ腺房細胞上皮細胞への分化調節腺管上皮化生 (ADM) は、他のシステムに比べて多くの利点を提供しています。本技術は、タンパク質発現の調節は簡単かつ迅速、分離、刺激や、ウイルスに感染し ADM プロセスを調査するプライマリ腺房細胞の培養を開始 1 日だけを必要とします。基底膜マトリックス、播種コラーゲン腺房細胞クラスターの私細胞外マトリックスを使用するとは異なり操作前に自分の腺房のアイデンティティを保持する腺房細胞ができます。これは重要な司令官の誘導するさまざまなコンポーネントの貢献をテストするときサイトカインやその他の異所萌出へ投与の要因の効果はこのテクニックを通してテストであるだけでなく、共通の突然変異や増加蛋白質の表現、蛋白質の表現のノックダウンの貢献はのウイルス感染によるテストプライマリ腺房細胞は、アデノ ウイルスやレンチ ウイルスのベクトルを使用して。さらに、細胞は、コラーゲンまたはエンドポイントで基底膜マトリックスから再分離できるので、蛋白質の表現の分析します。

Introduction

腺房の上皮化生 (ADM) は、膵炎とさらに追究する必要があります膵臓癌開発1の運転キー プロセス中に保護メカニズムです。膵臓癌の場合3の 90% に存在する発癌性のKRAS変異が戻って、腺房表現型4,5,への分化を防ぐため炎症誘起 ADM はリバーシブル2が、6。 養殖と 3 d 培養上皮細胞にプライマリ腺房細胞の差別化は、生体内で調査することは困難である ADM プロセスを制御する分子機構の研究。このような生体は、ADM、そのドライバーとその制御因子のリアルタイム可視化を有効にします。その下流のシグナル伝達経路の追究と同様、ADM プロセスのいくつかのドライバー確認されています。 またはメソッドを説明したことを確認使用するここ。ADM TGF-α 変換成長因子誘導が含まれます-mmp-7 (マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ-7) の発現と RANTES (発現し、分泌される; また知られている正常な T 細胞活性化の制御と同様、ノッチ7の活性化を介したケモカイン リガンド 5 または CCL5) として、tnf α (腫瘍壊死因子 α)-NF-κ B (核因子 κ B)8の活性化を介して ADM を誘導します。ADM の追加調停は発癌 KRas9,10, ADM egfr (上皮成長因子受容体) 遺伝子の発現の増加過程とその配位子、EGF (強化酸化ストレスの上昇を引き起こす表皮成長因子) と TGF α11

膵癌細胞株の in vitro 試験の共通は、一次電池文化は、多くの利点を提供しています。たとえば、非トランスジェニック マウスまたはKrasG12Dなど、開始遺伝子変異マウスからプライマリ腺房細胞は細胞数と制御遺伝子を持っているので ADM の初期イベントを研究するための最も適切なモデルを膵臓癌の開発の初期段階に存在する知られています。これは対照的に複数の変異を持つ多くの膵臓癌細胞株に通路番号12に基づく表現を変化させると。さらに、このような手段によって識別されるシグナル伝達経路は、動物実験によって検証されています。プライマリ腺房細胞を使用しての 1 つの警告は、典型的な癌細胞株はできるだけトランスフェクションできないのことです。

メソッドをここは、腺房細胞分離、覚醒剤を追加または、アデノ ウイルスやレンチ ウイルス感染だけでなく、さらなる分析のエンドポイントで細胞の再分離経由タンパク質の発現を調節することにより ADM を模した 3 D の文化の技術を詳しく説明します。

Protocol

すべての動物の仕事は、メイヨー クリニック IACUC によって承認されました。 1. 材料、ソリューション、および 3 次元行列の準備拠点します。 76 の mm の正方形で 500 μ m と 76 mm 105 μ m のポリプロピレン メッシュをカットします。半分より小さい 2 つ折り正方形を作成するために各正方形を折る。場所 1 つ 500 μ m と 1 つ 105 μ m メッシュ正方形のオートクレーブ袋?…

Representative Results

本プロトコルの完成が 1 日内で発生し、刺激、ADM は 3-5 日で見られます。図 1は、最初の日に手順 1 ~ 4 を完了するというメソッドのシーケンスを示しています。これはコラーゲンや基底膜マトリックスの準備、腺房の分離、ウイルス感染、埋込みを含まれます。TGF-α など、受ける刺激が必要私コラーゲン内腺房細胞基底膜マトリックスは、ADM ?…

Discussion

分離、感染、およびプライマリ腺房細胞のメッキのための時間の比較的短い時間は、この方法の利点です。対照的に、少し実践的な時間が必要ですが植副産物から腺房細胞を培養、腺房細胞13の副産物に 7 日ほどかかります。腺房分離14代替プロトコル ノート腺房細胞を取得する非常に簡単な方法しかし、EGF は、腺房細胞がそのプロトコルを使用して分離?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この仕事に支えられ R01 グラント (CA200572)、NIH から PS へ内容は、著者の責任国立がん研究所の公式見解を必ずしも表さないまたは輸出国家機関の資金提供者の役割がなかった研究デザイン、データの収集と分析、意思決定に発行、または原稿の準備。

Materials

37 °C shaking incubator Thermo Scientific SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubator NUAIRE NU-5500
50 ml tubes Falcon 352070
Absorbent pad, 20" x 24" Fisherbrand 1420662
Adenovirus, Ad-GFP Vector Biolabs  1060
Aluminum foil Fisherbrand 01-213-101
BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 Fisher Scientific  305167 Use as pins for dissection 
Beaker, 600 mL Fisherbrand FB-101-600
Bleach, 8.25% Clorox 31009
Cell Recovery Solution Corning 354253 Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript.
Centrifuge  Beckman Coulter Allegra X-15R Centrifuge
Collagenase Type I, Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C.
Dexamethasone Sigma D1756 Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. 
Ethanol, 200 proof Decon Laboratories  2701
Fetal Bovine Serum  Sigma F0926-100mL
Forceps  Fine Science Tools 11002-12
Forceps  Fine Science Tools 91127-12
Glass slide, 8-well Lab-Tek 177402
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red Fisher Scientific SH3048801   
Ice bucket, rectangular Fisher Scientific  07-210-103
Instant Sealing Sterilization Pouch Fisherbrand 01-812-51
LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)  Minigrip SBL2X69S
Lentiviral Packaging Mix, Virapower Invitrogen 44-2050
Matrigel Corning 356234 Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript.
Parafilm Bemis PM992 Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript.
PBS Fisher Scientific SH30028.02
Penicillin-Streptomycin  ThermoFisher Scientific 15140122
Pipet tips, 10 µl USA Scientific 1110-3700
Pipet tips, 1000 µl  Olympus Plastics 24-165RL
Pipet tips, 200 µl  USA Scientific 1111-1700
Pipet-Aid Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl Gilson F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl Gilson F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl Gilson F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl Gilson F123601
Pipettes, 10 ml  Falcon 357551
Pipettes, 25 ml Falcon 357525
Pipettes, 5 ml  Falcon 357543
Plate, 12-well Corning Costar 3513
Plate, 24-well plate Corning Costar 3524
Plate, 35 mm Falcon 353001
Plate, 6-well Falcon 353046
Polybrene EMD Millipore TR-1003-G Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. 
Polypropylene Mesh, 105 µm Spectrum Labs 146436
Polypropylene Mesh, 500 µm  Spectrum Labs 146418
Scissors  Fine Science Tools 14568-12
Scissors  Fine Science Tools 91460-11
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) Fisher Scientific BP328-500
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
Soybean Trypsin Inhibitor 8 Gibco 17075029
Spatula Fisherbrand 21-401-10
Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters  Millipore SCGP00525
TGF-α R&D Systems 239-A-100
Type I Rat Tail Collagen Corning 354236
Waymouth MB 752/1 Medium (powder) Sigma W1625-10X1L
Weigh boat, hexagonal, medium  Fisherbrand 02-202-101

参考文献

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記事を引用
Fleming Martinez, A. K., Storz, P. Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture. J. Vis. Exp. (144), e59096, doi:10.3791/59096 (2019).

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