概要

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

Published: August 15, 2019
doi:

概要

このプロトコルの目的は、感染後にマウスの複数の器官からジカウイルスを分離および定量化することによってウイルス性疾患を調査するために使用される技術を実証することです。

Abstract

提示されている方法は、ジカウイルス感染動物からの臓器の単離およびウイルス負荷の定量化のための実験室手順を示す。この手順の目的は、感染後の異なる時点または異なる実験条件下でマウスの末梢およびCNS領域におけるウイルス力を定量化し、ジカウイルス感染を調節するウイルス学的および免疫学的要因を同定することです。実証された臓器分離手順は、ウイルス力価の焦点形成アッセイ定量と定量的PCR評価の両方を可能にする。急速な器官の隔離の技術はウイルスの間数の維持のために設計されている。フォーカス形成アッセイによるウイルスチター定量は、ジカウイルスの迅速なスループット評価を可能にする。焦点形成アッセイの利点は、感染性ウイルスの評価であり、このアッセイの限界は、検出の限界を減少する器官毒性の可能性である。ウイルス価価評価は定量的PCRと組み合わせられ、臓器内の組換えRNAコピー制御ウイルスゲノムコピー数を使用して検出の限界を低く評価する。全体的にこれらの技術は、ジカウイルス感染動物の周辺およびCNSにおけるジカウイルス力挙子の分析のための正確な迅速な高スループット法を提供し、ほとんどの感染動物の器官におけるウイルス力中剤の評価に適用することができるデングウイルスを含む病原体。

Introduction

ジカウイルス(ZIKV)は、フラボリダ科に属するアルボウイルスであり、ポワッサンウイルス(POWV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、および西ナイルウイルス(WNV)1などの重要な神経侵襲性ヒト病原体を含む。その隔離と同定に続いて、アフリカとアジア2、3、4、5、および中南米内の流行のヒトZIKV感染の定期的な報告があった(参照6)しかし、ZIKVが重篤な疾患7を引き起こすと考えられていたのは最近になってからでした。現在、ZIKV感染に関連する神経疾患および出生時欠損の症例が数千例ある。ZIKVの急速な出現は、疾患の重症度の増加がある理由、ZIKV感染に対する免疫学的反応とは何か、神経学的増加に関連するウイルスおよび/または免疫媒介病理があるか、に関連する多くの疑問を引き起こしている。症状と出生時欠損。現在、ZIKVに関連する中枢神経系(CNS)関連疾患と、ZIKVに対する抗ウイルスおよびワクチンの有効性を迅速にテストする必要性を理解するラッシュがあります。このような背景から、ZIKV特異的フォーカス成形アッセイ(FFA)を用いた周辺およびCNSの両方におけるZIKV力中剤の迅速な分析方法を開発したのです。

小動物モデルは、疾患の進行を理解し、ワクチン、治療薬、抗ウイルス剤の早期評価のために重要です。我々は、ウイルス病原体8、9、10、11に対するヒト感染と保護をモデル化するために様々なマウス株を使用して、アルボウイルス病の研究のための小動物モデルを確立しました。 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21、22。この経験を活かして、WNVおよびデングウイルス、CNS21、23の両方の末梢器官におけるZIKV力価の評価のための関連フラビウイルスの評価に用いられる技術を改変し始めました。24.他のアッセイに対するこれらの方法の利点: 1) 彼らは分析のための末梢とCNS臓器の両方を収穫する能力を組み合わせること;2)方法は、同じ器官内の同じ動物上のウイルス力と一緒に、自然および適応免疫応答の測定のために、フローサイトメトリーに適応可能である。3)収穫技術は組織学的分析に適応可能である。4)ZIKV FFAは、ウイルス力板分析のための急速な高スループット法です。5)これらの方法は、ほとんどの病原体25に感染した動物の器官におけるウイルス力学者の評価に適用することができる。

Protocol

本研究のすべての手順は、セントルイス大学動物ケア・使用委員会が定めたガイドラインに従っています。SLUは、ラボアニマルケアインターナショナル(AAALAC)の評価と認定協会によって完全に認定されています。 1. 臓器分離 注:ウイルスは室温(RT)で安定していないため、一度に採取した動物の数は、ウイルスの水位を維持するために慎重?…

Representative Results

上記のIfnar1-/-マウスを用いてZIKV力電力を評価し、フットパッドへの皮下(SC)注射を介してZIKV(PRVABC59)に感染した。ここで、ZIKVの1 x 105 FFUを8〜12週齢のIfnar1-/-マウスSCに投与しても致死的ではないが、ウイルスは周辺およびCNSの両方で複製することができる。この用量および経路は、宿主病原体免疫応答および病原性を研究するため?…

Discussion

ZIKV感染は神経疾患を引き起こす可能性があるため、現在の動物モデルは、ワクチンおよび抗ウイルス剤の病因、免疫応答および保護有効性を研究するために、CNS内のウイルス制御に焦点を当てる必要がある。CNS疾患に焦点を当てる上での課題の一つは、多くの場合、末梢感染症の研究を犠牲にして来るということです。ここで提案される臓器分離方法は、CNS媒介性ZIKV関連疾患を評価し、抗?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ピント博士は、セントルイス大学医学部のシード助成金とセントルイス大学医学部のスタートアップ資金から資金を提供しています。ブライアン博士は、NIH NIAIDからK22AI104794早期調査者賞とセントルイス大学学校からの種子助成金によって資金提供されています。資金提供を受けたすべての個人に対して、資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に役割を持ちなかった。

Materials

1-bromo-3-chloropropane (BCP) MRC gene BP151
10cc syringe Thermo Fisher Scientific BD 309642
18G needle Thermo Fisher Scientific 22-557-145
1cc TB syringe Thermo Fisher Scientific 14-823-16H
20cc syringe Thermo Fisher Scientific 05-561-66
24 tube beadmill Thermo Fisher Scientific 15 340 163
3.2 mm stainless steel beads Thermo Fisher Scientific NC9084634
37C Tissue Culture incubator Nuair 5800
4G2 antibody in house
96 well flat bottom plates Midsci TP92696
96well round bottom plates Midsci TP92697
Basix 1.5ml eppendorf tubes Thermo Fisher Scientific 02-682-002
Concentrated Germicidal Bleach Staples 30966CT
CTL S6 Analyzer CTL CTL S6 Universal Analyzer
curved cutting scissors Fine Science Tools 14061-11
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose MilliporeSigma D5671
Ethanol (molecular biology-grade) MilliporeSigma e7023
Fetal Bovine Serum MilliporeSigma F0926-500ML
Forceps Fine Science Tools 11036-20
Glacial acetic acid MilliporeSigma 537020
Goat anti-mouse HRP-labeled antibody MilliporeSigma 8924
HEPES 1 M MilliporeSigma H3537-100ML
Isopropanol (molecular biology-grade) MilliporeSigma I9516
Ketamine/Xylazine cocktail Comparative Medicine
L-glutamine MilliporeSigma g7513
Magmax RNA purification kit Thermo Fisher Scientific AM1830
Methylcellulose MilliporeSigma M0512
Microcentrifuge Ependorf 5424R
MiniCollect 0.5ml EDTA tubes Bio-one 450480
o-ring tubes Thermo Fisher Scientific 21-403-195
one step q RT-PCR mix Thermo Fisher Scientific 4392938
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific EMS- 15713-S
Phosphate Buffered Saline MilliporeSigma d8537-500ml
Proline multichannel pipettes Sartorius 72230/72240
Proline single channel pipettes Sartorius 728230
RNAse free water Thermo Fisher Scientific 10-977-023
RNAzol BD MRC gene RB192
Rocking Platform Thermo Fisher Scientific 11-676-333
RPMI 1640 Fisher MT10040CV
Saponin MilliporeSigma s7900
spoon/spatula Fine Science Tools 10090-17
straight cutting scissors Fine Science Tools 14060-11
Triton X-100 MilliporeSigma t8787
True Blue Substrate VWR 95059-168
Trypsin MilliporeSigma T3924-100ML

参考文献

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記事を引用
Brien, J. D., Hassert, M., Stone, E. T., Geerling, E., Cruz-Orengo, L., Pinto, A. K. Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse. J. Vis. Exp. (150), e59632, doi:10.3791/59632 (2019).

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