概要

直接気管内リポ多糖刺激によるマウスの急性肺損傷の誘導

Published: July 06, 2019
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概要

ここでは、直接気管内リポ多糖類の含有によってマウスの急性肺損傷を誘発し、血液サンプル、気管支藻胞洗浄液、および肺組織のFACS分析を行うステップバイステップの手順です。最小限の侵襲性、簡単な処理、良好な再現性、および疾患の重症度の滴定は、このアプローチの利点です。

Abstract

リポ多糖類(LPS)の気道投与は、小動物モデルにおける肺炎症および急性肺損傷(ALI)を研究する一般的な方法である。エアロゾル化LPSの吸入、鼻または気管内刺激など、様々なアプローチが記載されている。提示されたプロトコルは、直接気管内LPS浸透によってマウスにALIを誘導し、血液サンプル、気管支藻胞洗浄(BAL)流体、および肺組織のFACS分析を行う詳細なステップバイステップ手順を説明する。食肉中の静下後、気管が露出し、LPSは22G静脈カテーテルを介して投与される。白血病細胞の侵入、炎症性サイトカインのアップレギュレーション、およびアルベオロ毛細血管バリアの破壊を伴う堅牢で再現可能な炎症反応は、使用されるLPS投与量に応じて、数時間以内に誘発される。血液サンプルの収集、BAL流体、および肺採取、ならびにFACS分析のための処理は、プロトコルで詳細に説明されています。無菌LPSの使用は、感染症における薬理学的介入を研究するのに適していないが、記載されたアプローチは、最小限の侵襲性、簡単な取り扱い、および機械的免疫学的な質問に答えるために良好な再現性を提供する。さらに、用量滴定だけでなく、代替LPS製剤またはマウス株の使用は、ALIの重症度または疾患症状の早期発症の異なる程度を示すことができる臨床効果の変調を可能にする。

Introduction

基本的な免疫研究には実験動物モデルが欠かせません。全細菌または微生物成分の投与は、局所的または全身的な炎症誘発する小動物モデルで頻繁に使用されている1.リポ多糖類(LPS、または細菌エンドトキシン)は、グラム陰性菌(例えば、腸内細菌科、シュードモナス属、またはレジオネラ属)の細胞壁成分および表面抗原である。熱安定および大きな分子(分子量1-4 x 106 kDa)は、脂質部分(脂質A)、コア領域(オリゴ糖)、およびO多糖類(またはO抗原)から構成される。脂質Aは、その疎水性脂肪酸鎖で、分子を細菌膜に固定し、LPSの免疫活性および毒性を仲介する(細菌の分解時に)。LPS結合タンパク質(LBP)への結合に続いて、LPS:LBP複合体は、多くの細胞タイプの表面に位置するCD14/TLR4/MD2受容体複合体をリゲートし、NF-κB核転位およびその後のアップレギュレーションとの強い炎症反応を誘発するサイトカイン発現の 2.

急性肺損傷(ALI)は、心不全3の不在における両側肺水腫を伴う急性低酸素呼吸不全として定義される。LPSの気道投与は、肺炎症およびALI4、5、6、7を誘導する一般的な方法である。無菌物質は感染症における薬理学的介入の研究には適していないが、機械的免疫学的な質問は十分な精度で答えられるかもしれない。気管へのLPSの注入は、LPS投与量3に応じて、白血病の侵入、炎症性サイトカインのアップレギュレーション、および数日以内にアルバオロ毛細血管障壁の破壊を伴う強い炎症反応を誘発する、 6,7.

提示されたプロトコルは、気管内LPSインスティレーションによってマウスにALIを誘導するための詳細なステップバイステップ手順を説明する。このモデルは、サイトカイン発現、好中球顆粒球侵襲、および前述の8.aveolarアルブミン漏出を評価することによって検証された。

Protocol

この動物プロトコルは、動物の世話のための地元の委員会(LANUV、レックリングハウゼン、ドイツ、プロトコルNo.84-02.04.2015)によって承認され、生きた動物の使用のための国立衛生研究所のガイドラインに従って行われました(NIH出版物)。No.85-23,1996年改訂)。 1. ALI誘導 約10-12週の年齢で成人C57BL/6マウスを使用してください。水と標準的なげっ歯類チョウへの無料アク…

Representative Results

マウスにおけるALIを誘導する記載のアプローチは、サイトカイン発現、好中球顆粒球浸潤、および肺静脈毛細血管障害破壊24時間およびLPS浸潤後72時間を評価することによって検証された。PBS注入動物は、コントロールとして役立った。気管内LPS投与は、強い肺炎症反応を誘発した。肺組織におけるTNF-αの発現は有意にアップレギュレートされ、対照動物[RQ(TNF-α/18s);24時間:53.7(SD=11.6)、72 h:55.0(…

Discussion

最低の侵襲性、簡単な処理およびよい再現性は小さいげっ歯類モデルのALIを誘発するために提示されたアプローチの主要な特徴である。動物モデルにおける全細菌の代わりにLPSを使用すると、利点があります。それは安定した、純粋な化合物であり、使用するまで凍結乾燥された形態で貯えることができる。これは、TLR4経路を介した自然免疫応答のための強力な刺激剤であり、その生物学的…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、ヤン・クライナーとスザンヌ・シュルツに技術サポートを提供してくれたことに感謝したいと考えている。著者らは、ボン大学の医学部におけるフローサイトメトリーコア施設の優れたサポートを認めている。著者は外部組織から資金を受け取っていなかった。 結果セクションで示され、図 3に示されているデータの一部は、既に前のパブリケーション8に示されています。

Materials

1 ml syringes BD, Franklin Lakes, NJ, USA 300013
10 ml syringes BD, Franklin Lakes, NJ, USA 309110
Anti-CD115 (c-fms) APC Thermo Fisher, Waltham, MA, USA 17-1152-80
Anti-CD11b (M1/70) – FITC Thermo Fisher, Waltham, MA, USA 11-0112-81
Anti-CD45 (30-F11) – eF450 Thermo Fisher, Waltham, MA, USA 48-0451-82
Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 Thermo Fisher, Waltham, MA, USA 25-4801-82
Anti-Gr1 (RB6-8C5) BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA 552093
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 Thermo Fisher, Waltham, MA, USA 45-5932-82
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 Bio Legend, San Diego, CA 127623
Buprenorphine hydrochloride Indivior UK Limited, Berkshire, UK
C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old Charles River, Wilmongton, MA, USA
CaliBRITE APC-beads (6µm) BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA 340487
Canula 23 gauge 1'' BD, Franklin Lakes, NJ, USA 300800
Canula 26 gauge 1/2'' BD, Franklin Lakes, NJ, USA 303800
Cell strainer 70 µm BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA 352350
Collagenase Type I Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 1148089
Deoxyribonuclease II Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA D8764 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA D8662
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA D8537
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA E7889
FACS tubes, 5 ml Sarstedt, Nümbrecht, Germany 551579
Fetal calf serum (FCS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F2442
Forceps Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 11049-10
Isoflurane Baxter, Unterschleißheim, Germany
Ketamine hydrochloride Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA L2630
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit Thermo Fisher, Waltham, MA, USA L23101
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 BD, Franklin Lakes, NJ, USA 553141
Red blood cell lysis buffer Thermo Fisher, Waltham, MA, USA 00-4333-57
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA R8758
Scissors Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 14060-09
Sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA S2002
Spring scissors Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 15018-10
Tissue forceps Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 11021-12
Tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 30125150
Venous catheter, 22 gauge B.Braun, Melsungen, Germany 4268091B
Xylazine hydrochloride Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany

参考文献

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記事を引用
Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation. J. Vis. Exp. (149), e59999, doi:10.3791/59999 (2019).

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