概要

物理的および同方性拡張によるヒト組織切片のナノスコピックイメージング

Published: September 25, 2019
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概要

臨床組織サンプルのナノスケールイメージングは、疾患病因の理解を向上させることができる。拡張病理学(ExPath)は、標準的な臨床組織サンプルとの互換性のために改変された拡張顕微鏡(ExM)のバージョンであり、従来の回折制限顕微鏡を用いて生体分子のナノスケール構成を探索する。

Abstract

現代の病理学では、顕微鏡検査は臨床標本の顕微鏡構造を明らかにすることによって疾患診断において重要な役割を果たしている。しかし、基本的な物理的回折限界は、従来の光学イメージングアプローチを使用する場合、ナノスケールの解剖学および微妙な病理学的変化の尋問を防ぐ。ここでは、固定凍結またはホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織の両方を含む一般的なタイプの臨床原発組織標本のナノスケール光学イメージングのための拡張病理学(ExPath)と呼ばれるシンプルで安価なプロトコルを説明します。セクション。この方法は、組織サンプルを組織ヒドロゲルハイブリッドに化学的に変換し、純粋な水中の複数のスケールにわたってそれらを物理的に同位体に拡張することにより、光回折限界を回避します。膨張により、従来の溶解不可能な分子が分離され、従来の光学顕微鏡を用いて観察することができます。

Introduction

3次元(3D)コンテキストで組織の分子組織を調べると、生物学的機能と疾患の発症に関する新たな理解が可能になります。しかしながら、これらのナノスケール環境は、従来の回折制限顕微鏡(200−300nm)の分解能を超え、最小の溶解可能距離、dはdαλ/NAによって定義 <!––> される。ここでλは光の波長であり、NAは撮像システムの数値絞り(NA)である。 近年、新たに開発した超解像画像技術1、2、3、刺激放出を含む蛍光標識分子の直接可視化が可能となった。光活性化局在顕微鏡(PALM)、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、および構造化イルミネーション顕微鏡(SIM)。これらのイメージング技術は、ナノスケールでの生物学的機能の理解に革命を起こしましたが、実際には、高価な機器や特殊な機器や画像処理ステップに頼ることが多く、取得時間が遅くなる可能性があります。従来の光学イメージングでは、特定の特性を持つ蛍光体(光スイッチング能力や高い光安定性など)が必要です。さらに、組織標本に対して3D超解像イメージングを行うのも課題です。

2015年4月に初めて導入された拡張顕微鏡検査(ExM)は、膨らむポリ電解質ヒドロゲルに埋め込まれた保存サンプルを物理的に拡張することにより、ナノスケールの特徴(<70 nm)をイメージングする代替手段を提供します。ここで、主要な生体分子および/または標識は、化学処理後に同位体的に拡張することができるポリマーネットワークにその場所に固定される。物理的な膨張は全く有効な分解能を増加させるので、目的の分子は、従来の回折制限されたイメージングシステムを使用して解決することができる。カスタム合成蛍光標識がポリマーネットワーク4に固定された元のプロトコルの公開以来、新しい戦略は、タンパク質(タンパク質保持ExM、またはproExM)5を直接固定するために使用されてきた。6,7,8,9および RNA9,10,11,12ヒドロゲルに, 反復を介して物理的な倍率を増加させる拡張13または適応ゲル化学8、14、15.

ここでは、臨床病理学フォーマット用に最適化された拡張病理学(ExPath)16と呼ばれるproExMの適応バージョンを提示します。このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色、ガラススライドに取り付けられた新鮮な凍結ヒト組織標本を含む臨床サンプルをExMと互換性のある状態に変換します。タンパク質は、次にヒドロゲルに固定され、機械的均質化が行われる(図1)16。サンプルの4倍の線形膨張により、約300nmの分解能しか持たない従来の共焦点顕微鏡を使用して多色超解像(〜70nm)画像を得ることができ、他の超解像イメージング技術と組み合わせることもできます。

Protocol

1. ストック試薬およびソリューションの準備 ゲル化溶液成分を調調します。注:溶液濃度は g/mL (w/v%) で与えられます。 以下のストックソリューションを作る:38%(w/v)アクリル酸ナトリウム(SA)、50%(w/v)アクリルアミド(AA)、2%(w/v)N、N’-メチレベジサクリラム化物(ビス)、および29.2%(w/v)塩化ナトリウム(NaCl)。二重脱イオン水(ddH2 O)に化合物を溶解する。表 1…

Representative Results

プロトコルが正常に実行された場合(図1)、サンプルは機械的均質化後に平らで透明なゲルとして現れ(図3A)、水中で3−4.5倍の膨張が可能です(図3B)。5、16を使用した最終的な膨張因子およびイメージングシステムに応じて〜70nmの有効な決断を提供する。<stron…

Discussion

ここでは、FFPE、H&E染色、ガラススライド上の新鮮な凍結標本を含む病理学で使用される最も一般的なタイプの臨床生検サンプルに適用できるProExM5のバリアントであるExPathプロトコル16を提示する。フォーマット変換、抗原検索、および検体の免疫染色は、ExPathに特異的ではない一般的に使用されるプロトコルに従います。元のproExMプロトコル…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、カーネギーメロン大学(YZ)とNIHディレクターの新イノベーター賞(DP2 OD025926-01からYZ)の教員立ち上げ基金によって支援されました。

Materials

4-hydroxy-TEMPO (4HT) Sigma Aldrich 176141 Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) Cellvis P06-1.5H-N
Acetone Fischer Scientifc A18-500
Acrylamide Sigma Aldrich A8887
Acryloyl-X, SE (AcX) Invitrogen A20770
Agarose Fischer Scientifc BP160-100
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich A3678 Initiatior
Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit Sigma Aldrich HPA001873
Anti-Collagen IV antibody produced in mouse Santa Cruz Biotech sc-59814
Anti-Vimentin antibody produced in chicken Abcam ab24525
Aqua Hold II hydrophobic pen Scientific Device 980402
Breast Common Disease Tissue Array Abcam ab178113
DAPI (1 mg/mL) Thermo Scientific 62248 Nuclear stain
Diamond knife No. 88 CM General Tools 31116
Ethanol Pharmco 111000200
Ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) 0.5 M
VWR BDH7830-1
FFPE Kidney Sample USBiomax HuFPT072
Forceps
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A Biotium 20020
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 Biotium 20121
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 Invitrogen A11010
MAXbind Staining Medium Active Motif 15253 Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.
MAXblock Blocking Medium Active Motif 15252 Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.
MAXwash Washing Medium Active Motif 15254 Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.
Micro cover Glass #1 (24x60mm) VWR 48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) VWR 48393 251
N,N,N′,N′-
Tetramethylethylenediamine (TEMED)
Sigma Aldrich T9281 Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide Sigma Aldrich M7279
Normal goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121 For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish Thermo Fisher 167063 Multi-well plastic culture dish
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish Thermo Fisher 140675
Nunc 15mL Conical Thermo Fisher 339651
Nunc 50mL Conical Thermo Fisher 339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution Fischer Scientifc BP399-1
Plastic Petri Dish (100 mm) Fischer Scientifc FB0875713
Proteinase K (Molecular Biology Grade) Thermo Scientific EO0491
Razor blade Fischer Scientifc 12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Thermo Fisher 3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL Thermo Fisher 3459
Sodium acrylate Sigma Aldrich 408220
Sodium chloride Sigma Aldrich S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich C8532-1KG
Tris Base Fischer Scientifc BP152-1
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Wheat germ agglutinin labeled with CF640R Biotium 29026
Xylenes Sigma Aldrich 214736

参考文献

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記事を引用
Klimas, A., Bucur, O., Njeri, B., Zhao, Y. Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion. J. Vis. Exp. (151), e60195, doi:10.3791/60195 (2019).

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