本報告では、複数の単一細胞の高効率ペアリングと顕微鏡解析を実現する単一細胞培養実験を設定するマイクロ流体チップベースの方法について説明する。
細胞共培養アッセイは、がんを含む疾患の生物学をよりよく理解するために、異なる細胞タイプ間の細胞間相互作用を研究するために広く使用されてきました。しかし、細胞亜集団の不均一性が平均値によって不明瞭であるため、従来の共培養システムを用いた高度異種細胞集団における細胞間相互作用の複雑なメカニズムを明らかにすることは困難である。従来の共培養システムは、集団信号を記述するためにのみ使用できますが、個々の細胞の挙動を追跡することはできません。さらに、従来の単細胞実験法はポアソン分布により細胞操作の効率が低い。微細加工デバイスは、単一細胞研究のための新しい技術であり、高スループットで単一細胞を正確に操作でき、サンプルおよび試薬の消費量を削減できるためです。ここでは、複数の単細胞共培養に対するマイクロ流体チップの概念と応用について述べている。このチップは、培養室内の複数のタイプの単一細胞を効率的に捕捉できる(~46%)単一細胞レベルでの細胞相互作用下での細胞の挙動(例えば、移動、増殖など)を研究するのに有用な十分な培養空間を有する。リンパ内皮細胞と経口扁平上皮癌は、複数の単細胞相互作用研究のためのマイクロ流体プラットフォーム上で単一細胞共培養実験を行うために使用された。
異なるタイプの単一細胞の効率的な捕捉と十分な培養空間の提供は、複数のタイプの単一細胞1の単一細胞共培養実験に必要である。希釈を制限することは、必要な機器の低コストのために、このような実験のために単一細胞を調圧するために最も一般的に使用される方法です。しかし、ポアソン分布の制限により、最大単一細胞獲得確率はわずか37%であり、実験操作は手間と時間のかかる2を作る。これに対し、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いることは、単一細胞3を高効率に調製するポアソン分布の限界を克服できる。ただし、高額な計装費やメンテナンスコストにより、一部のラボではFACSにアクセスできない場合があります。微細加工デバイスは、最近、単一細胞トラッピング4、単一細胞ペアリング5、および単一細胞培養用途用に開発された。これらの装置は、単一細胞6を正確に操作する能力、ハイスループット実験を行う、またはサンプルおよび試薬の消費量を減らす能力に基づいて有利である。しかし、現在のマイクロ流体デバイスを用いて複数の細胞型を用いて単一細胞共培養実験を行うことは、ポアソン分布1、7、8、または不能の制限のために依然として困難である。2種類以上の単一セル4、5、6、9、10をキャプチャするデバイス。
例えば、ユンらは細胞相互作用研究11のためのマイクロ流体装置を報告した。この装置は1つの部屋の細胞を対一にするために確率的な方法を使用する。ただし、デバイス構造の幾何学的制限により、2 つの異なるセル タイプのペアリングのみが実現できます。Leeらからの別の報告は、単一細胞12を捕捉し、対にする確定的方法を実証した。この装置は、確定的方法によってペアリング効率を高めるが、細胞のペアリングに必要な長時間の操作時間によって制限される。具体的には、第2の細胞捕捉は、24時間後に最初に捕捉された細胞が表面に取り付けられた後にのみ行うことができる。液滴系マイクロ流体装置は依然としてポアソン分布に限定されており、非接続細胞でのみ使用でき、栽培過程で培養液を変更することはできないことが分かります。
以前は、決定論的な流体力を利用して複数のタイプの単細胞を培養室に捕捉し、その後細胞共培養実験を行って分析できるマイクロ流体「流体力学シャトルチップ」を開発しました。細胞相互作用における個々の細胞移動行動14.流体力学シャトルチップは、それぞれが蛇行バイパスチャネル、キャプチャサイト、および培養室を含むユニットの配列セットで構成されています。蛇行バイパスチャネルと培養室との間の流れ抵抗の差を使用することにより、特別に設計された操作手順により、異なるタイプの単一細胞を培養室に繰り返し捕捉することができる。特に、培養室の十分なスペースは、細胞の捕捉中に細胞がフラッシュされるのを防ぐだけでなく、細胞が広がり、増殖し、移動するのに十分なスペースを提供し、生きている単一細胞相互作用を観察することを可能にする。この記事では、このデバイスの生産と詳細なプロトコル手順に焦点を当てます。
腫瘍微小環境における様々な細胞間相互作用は、腫瘍17の進行において重要な役割を果たす。細胞相互作用のメカニズムを理解するために、共培養システムは一般的な分析方法として使用される。しかし、複数の細胞型と細胞自体の不均一性は、実験的な複雑さと分析上の困難を引き起こしています。
流体力学シャトルチップは、希釈法およびマイクロ…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、科学技術省(105-2628-E-400-001-MY2)の助成金と、組織工学・再生医療の博士課程、国立中成大学、国立衛生研究所の助成を受けて行われました。
3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |