概要

マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する

Published: September 27, 2019
doi:

概要

本報告では、複数の単一細胞の高効率ペアリングと顕微鏡解析を実現する単一細胞培養実験を設定するマイクロ流体チップベースの方法について説明する。

Abstract

細胞共培養アッセイは、がんを含む疾患の生物学をよりよく理解するために、異なる細胞タイプ間の細胞間相互作用を研究するために広く使用されてきました。しかし、細胞亜集団の不均一性が平均値によって不明瞭であるため、従来の共培養システムを用いた高度異種細胞集団における細胞間相互作用の複雑なメカニズムを明らかにすることは困難である。従来の共培養システムは、集団信号を記述するためにのみ使用できますが、個々の細胞の挙動を追跡することはできません。さらに、従来の単細胞実験法はポアソン分布により細胞操作の効率が低い。微細加工デバイスは、単一細胞研究のための新しい技術であり、高スループットで単一細胞を正確に操作でき、サンプルおよび試薬の消費量を削減できるためです。ここでは、複数の単細胞共培養に対するマイクロ流体チップの概念と応用について述べている。このチップは、培養室内の複数のタイプの単一細胞を効率的に捕捉できる(~46%)単一細胞レベルでの細胞相互作用下での細胞の挙動(例えば、移動、増殖など)を研究するのに有用な十分な培養空間を有する。リンパ内皮細胞と経口扁平上皮癌は、複数の単細胞相互作用研究のためのマイクロ流体プラットフォーム上で単一細胞共培養実験を行うために使用された。

Introduction

異なるタイプの単一細胞の効率的な捕捉と十分な培養空間の提供は、複数のタイプの単一細胞1の単一細胞共培養実験に必要である。希釈を制限することは、必要な機器の低コストのために、このような実験のために単一細胞を調圧するために最も一般的に使用される方法です。しかし、ポアソン分布の制限により、最大単一細胞獲得確率はわずか37%であり、実験操作は手間と時間のかかる2を作る。これに対し、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いることは、単一細胞3を高効率に調製するポアソン分布の限界を克服できる。ただし、高額な計装費やメンテナンスコストにより、一部のラボではFACSにアクセスできない場合があります。微細加工デバイスは、最近、単一細胞トラッピング4、単一細胞ペアリング5、および単一細胞培養用途用に開発された。これらの装置は、単一細胞6を正確に操作する能力、ハイスループット実験を行う、またはサンプルおよび試薬の消費量を減らす能力に基づいて有利である。しかし、現在のマイクロ流体デバイスを用いて複数の細胞型を用いて単一細胞共培養実験を行うことは、ポアソン分布1、7、8、または不能の制限のために依然として困難である。2種類以上の単一セル4、5、6、9、10をキャプチャするデバイス。

例えば、ユンらは細胞相互作用研究11のためのマイクロ流体装置を報告した。この装置は1つの部屋の細胞を対一にするために確率的な方法を使用する。ただし、デバイス構造の幾何学的制限により、2 つの異なるセル タイプのペアリングのみが実現できます。Leeらからの別の報告は、単一細胞12を捕捉し、対にする確定的方法を実証した。この装置は、確定的方法によってペアリング効率を高めるが、細胞のペアリングに必要な長時間の操作時間によって制限される。具体的には、第2の細胞捕捉は、24時間後に最初に捕捉された細胞が表面に取り付けられた後にのみ行うことができる。液滴系マイクロ流体装置は依然としてポアソン分布に限定されており、非接続細胞でのみ使用でき、栽培過程で培養液を変更することはできないことが分かります。

以前は、決定論的な流体力を利用して複数のタイプの単細胞を培養室に捕捉し、その後細胞共培養実験を行って分析できるマイクロ流体「流体力学シャトルチップ」を開発しました。細胞相互作用における個々の細胞移動行動14.流体力学シャトルチップは、それぞれが蛇行バイパスチャネル、キャプチャサイト、および培養室を含むユニットの配列セットで構成されています。蛇行バイパスチャネルと培養室との間の流れ抵抗の差を使用することにより、特別に設計された操作手順により、異なるタイプの単一細胞を培養室に繰り返し捕捉することができる。特に、培養室の十分なスペースは、細胞の捕捉中に細胞がフラッシュされるのを防ぐだけでなく、細胞が広がり、増殖し、移動するのに十分なスペースを提供し、生きている単一細胞相互作用を観察することを可能にする。この記事では、このデバイスの生産と詳細なプロトコル手順に焦点を当てます。

Protocol

1. 柔らかいリソグラフィーによるウエハ金型の製造 注: マスク パターン データは、以前のパブリケーション14で使用できます。 4インチのシリコンウェーハを120°Cのオーブンで15分間脱水します。 SU-8 2陰性フォトレジストのスピンコート4gを1,000rpmの4インチシリコンウエハに30sで取り付け、5μmの厚い層(層#1)を作成します。 柔らか?…

Representative Results

このデバイスは、切断されたPDMS装置の断面写真に示すように3層構造を有する(図1A)。最初の層には、培養室とバイパスチャネルを接続するキャプチャサイト(幅6.0 μm、高さ4.6μm)が含まれています。培養室とバイパスチャネルの間の流れ抵抗の違いにより、細胞は捕捉位置に流れ込み、小さな経路の入り口を埋めます。セルがキャプ?…

Discussion

腫瘍微小環境における様々な細胞間相互作用は、腫瘍17の進行において重要な役割を果たす。細胞相互作用のメカニズムを理解するために、共培養システムは一般的な分析方法として使用される。しかし、複数の細胞型と細胞自体の不均一性は、実験的な複雑さと分析上の困難を引き起こしています。

流体力学シャトルチップは、希釈法およびマイクロ…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、科学技術省(105-2628-E-400-001-MY2)の助成金と、組織工学・再生医療の博士課程、国立中成大学、国立衛生研究所の助成を受けて行われました。

Materials

3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape 3M Company 9795R
Antibiotics Biowest L0014-100 Glutamine-Penicillin-Streptomycin
AutoCAD software Autodesk AutoCAD LT 2011 Part No. 057C1-74A111-1001
CellTracke Blue CMAC Dye Invitrogen C2110
CellTracker Green CMFDA Dye Invitrogen C7025
Conventional oven YEONG-SHIN company ovp45
Desiccator Bel-Art Products F42020-0000 Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
DiIC12(3) cell membrane dye BD Biosciences 354218 Used as a cell tracker
DMEM-F12 medium Gibco 11320-082
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 PromoCell C-22022
Fetal bovine serum Hyclone Thermo SH30071.03HI
Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) Hamilton 80630 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2
Harris Uni-Core puncher Ted Pella Inc. 15075 with 1.5mm inner-diameter
Harris Uni-Core puncher Ted Pella Inc. 15071 with 0.5mm inner-diameter
Hotplate YOTEC company YS-300S
Msak aligner Deya Optronic CO. A1K-5-MDA
Oxygen plasma NORDSON MARCH AP-300
Plasma cleaner Nordson AP-300 Bench-Top Plasma Treatment System
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit Dow corning Sylgard 184
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) Ever Sharp Technology, Inc. TFT-23T inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm
Removable tape 3M Company Scotch Removable Tape 811
Silicon wafer Eltech corperation SPE0039
Spin coater Synrex Co., Ltd. SC-HMI 2" ~ 6"
Stereomicroscope Leica Microsystems Leica E24
SU-8 10 negative photoresist MicroChem Y131259
SU-8 2 negative photoresist MicroChem Y131240
SU-8 2050 negative photoresist MicroChem Y111072
SU-8 developer Grand Chemical Companies GP5002-000000-72GC Propylene glycol monomethyl ether acetate
Syringe pump Harvard Apparatus 703007
Trichlorosilane Gelest, Inc SIT8174.0 Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Trypsin Neutralizer Solution Gibco R-002-100

参考文献

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記事を引用
He, C., Chen, Y., Wang, S., Hsu, C. Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip. J. Vis. Exp. (151), e60202, doi:10.3791/60202 (2019).

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