概要

患者由来膵管腺癌オルガノイドモデルの単離と特徴付け

Published: January 14, 2020
doi:

概要

膵管腺癌の患者由来オルガノイド培養は、高忠実度で上皮腫瘍細胞コンパートメントを表す急速に確立された3次元モデルであり、この致死性悪性腫瘍に対する翻訳研究を可能にする。ここでは、オルガノイドを確立し、伝播する方法を詳細に提供するとともに、これらのモデルを用いて関連する生物学的アッセイを行う方法を提供する。

Abstract

膵管腺癌(PDAC)は、最も致死的な悪性腫瘍の一つである。近年、この疾患の3次元(3D)モデリングを可能にする次世代オルガノイド培養法が挙げられている。患者由来オルガノイド(PDO)モデルは、外科検体および小さな生検の両方から単離し、培養中に急速に形成することができる。重要なことに、オルガノイドモデルは、患者の腫瘍で検出された病原性遺伝子変化を保持し、患者の治療応答を予測するので、翻訳研究を可能にする。ここでは、3D、マトリックス埋め込み、オルガノイドモデルを研究するために組織培養ワークフローを適応するための包括的なプロトコルを提供します。原発性PDACオルガノイドの分離と伝播に関する方法と考慮事項について詳しく説明します。さらに、実験室でオルガノイドメディアがどのように調製され、品質を制御しているかを説明します。最後に、核酸(DNAおよびRNA)の単離、薬物検査などのオルガノイドモデルの下流特性評価のためのアッセイについて説明します。重要なことは、研究室でオルガノイド方法論を実装するための重要な考慮事項を提供することです。

Introduction

膵管腺癌(PDAC)は、ほとんどの患者における後期診断、有効な治療法の欠如、および結果として10%1未満のままである低5年全体生存率を特徴とする致死性疾患である。患者のわずか20%が治癒外科的介入に適した局所疾患と診断される2、3.残りの患者は、典型的には、患者4、5の少数派に有効である化学療法剤の組み合わせで治療される。これらの差し迫った臨床ニーズに対応するために、研究者は早期発見戦略とより効果的な治療法の開発に積極的に取り組んでいます。重要な発見の臨床翻訳を加速するために、科学者は遺伝子操作されたマウスモデル、患者由来の異種移植片、単層細胞ライン、および、最近ではオルガノイドモデル6を採用している。

未変形前駆細胞の増殖を刺激する増殖因子およびWnt-リガンド豊富な条件を用いた三次元上皮オルガノイド培養は、まずマウス腸7について説明し、正常ヒト膵臓組織8に迅速に適応した。正常な乳管組織に加えて、オルガノイド方法論は、ヒトPDAC8の単離、膨張、および研究を可能にする。重要なことに、この方法は、外科検体からのオルガノイドの確立、ならびに細かいおよびコア針生検を支持し、研究者が疾患9、10のすべての段階を研究することを可能にする。興味深いことに、患者由来のオルガノイドは、よく記述された腫瘍転写サブタイプを要約し、精密医療プラットフォーム9、11の開発を可能にし得る。

PDACのための現在のオルガノイドプロトコルは、化学ナイーブ患者9からの患者サンプルの70%以上の正常な拡張を可能にする。ここでは、患者由来のPDACオルガノイドを単離、拡張、および特徴付けるために、当社の研究室で採用されている標準的な方法を提示します。他のPDACオルガノイド方法論は、12、13に記載されているが、これらの方法の比較は徹底的に行われていない。この技術は比較的新しく、急速に進歩しているので、これらのプロトコルは進化し続け、改善されることを期待しています。しかし、組織の取り扱いとオルガノイド培養の原理は引き続き有用であろう。

Protocol

研究用のすべてのヒト組織収集は、当社の内部審査委員会(IRB)によって審査され、承認されました。以下のプロトコルのすべては、哺乳動物組織培養実験室環境において無菌条件下で行われる。 1. メディアの準備 条件付きメディアの準備。注:ヒト膵臓オルガノイドメディアは、豊富な成長因子と栄養素だけでなく、オルガノイド拡張のための十分な成長刺激?…

Representative Results

PDACからのオルガノイドの分離に関連する課題を例示するために、小さな低細胞腫瘍サンプルから患者由来オルガノイド培養物の確立を示す。最初のめっき後、図1に示すように、ウェルごとに少数のオルガノイドしか見えなかった。オルガノイドは、2週間のスパンにわたって大きく成長させられ、より堅牢な文化を確立するために、我々のプロトコルに従って通過させ?…

Discussion

ここでは、患者由来PDACオルガノイドを分離、拡張、特徴付けするための現在のプロトコルを提示する。オルガノイド培養の確立に関する現在の成功率は70%を超えています。したがって、これらの方法はまだ完成されておらず、時間の経過とともに改善と進化が期待されています。PDACは腫瘍性細胞性が低いため、サンプルサイズに対して重要な考慮事項を考慮する必要があります。その結果?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

UCサンディエゴムーアズがんセンターバイオリポジトリと組織技術共有リソース、ローリー研究所のメンバー、および外科腫瘍学部門のUCサンディエゴ外科部門のサポートに感謝しています。AMLは、NIH CA155620、SU2C CRUKルストガルテン財団膵臓がんドリームチーム賞(SU2C-AACR-DT-20-16)、膵臓癌を治すための基金への寄付者によって寛大にサポートされています。

Materials

12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips
12 well plates Olympus 25-106
15 ml LoBind conical tubes Eppendorf EP0030122208
15 ml tube Rotator and/or nutator
37 °C CO2 incubator
37 °C water bath
384 well plates Corning 4588 Ultra low attachment, black and optically clear
A 83-01 TOCRIS 2939
ADV DMEM ThermoFisher 12634010
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Automated cell counter
B27 supplement ThermoFisher 17504044
Cell Recovery Solution Corning 354253 Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C
CellTiterGlow Promega G7570 Luminescence cell viability reagent
Chloroform Sigma C2432
Computer
CryoStor CS10 StemCELL Tech 07930 Cell Freezing Solution
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells Trevigen 3710-001-K
DMEM ATCC 30-2002
DNase I Sigma D5025
Drug printer Tecan D300e This is the drug printer we use in our laboratory
Excel For data analysis
Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools 11150-10
FBS ThermoFisher 16000044
G-418 ThermoFisher 10131035
Gastrin I (human) TOCRIS 3006
Gentle Collagenase/hyaluronidase STEMCELL Tech 7919
GlutaMAX ThermoFisher 35050061 Glutamine solution
GraphPad Prism For data analysis
HEPES ThermoFisher 15140122
Laminar flow tissue culture hood
Luminometer
L-Wnt-3A expressing cells ATCC CRL-2647
MACS Tissue Storage Solution Miltenyi biotec 130-100-008
Matrigel Matrix Corning 356230 Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced
Mr. Frosty Freezing Container ThermoFisher 5100-0001
N-Acetylcysteine Sigma A9165
Nicotinamide Sigma N0636
p1000 pipette with tips
p200 pipette with tips
PBS ThermoFisher 10010049
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15630080
primocin InvivoGen ant-pm-2
Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) ThermoFisher 121-0020
Recombinant Human FGF-10 Peprotech 100-26
Recombinant Murine Noggin Peprotech 250-38
Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade VWR 89176-380
Tissue culture centrifuge
Tissue Culture Dishes 10 cm Olympus 25-202
TRIZol ThermoFisher 15596018 Acid Phenol solution
TrypLE Express ThermoFisher 12605010
Y-27632 Sigma Y0503
Zeocin ThermoFisher R25001

参考文献

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記事を引用
Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. J. Vis. Exp. (155), e60364, doi:10.3791/60364 (2020).

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