概要

ナマコ腸細胞の一次培養におけるアポトーシス誘導と検出

Published: January 21, 2020
doi:

概要

このプロトコルは、ナマコアポスピコプスジャポニクスから腸細胞を培養するための扱いやすい方法を提供し、エキノデルマ、モルスカ、甲殻類を含む海洋生物から広く利用可能な様々な組織サンプルと互換性があります。

Abstract

一次培養細胞は、生物物質の機能評価や特定の生物学的活動の特徴付けのための非常に重要なツールとして、様々な科学的分野で使用されています。しかしながら、普遍的に適用可能な細胞培養培地およびプロトコルの欠如のために、海洋生物に対する細胞培養方法は依然として限定的である。一方、海洋無脊椎動物細胞の一般的に起こっている微生物汚染および多発性特性は、海洋無脊椎動物に対する効果的な細胞培養戦略の確立をさらに妨げる。ここでは、ナマコアポジコプスヤポニクスから腸細胞を培養するための扱いやすい方法について説明します。さらに、一次培養腸細胞におけるインビトロアポトーシス誘導および検出の例を提供する。また、本実験では、適切な培養培地及び細胞採取方法について詳細を提供する。記載されたプロトコルは、エキノデルマタ、モルスカ、および甲殻類を含む海洋生物から広く利用可能な様々な組織サンプルと互換性があり、複数のin vitro実験用途に十分な細胞を提供することができる。この技術により、研究者は海洋無脊椎動物からの一次細胞培養物を効率的に操作し、細胞上の標的生物学的物質の機能的評価を容易にすることが可能になる。

Introduction

人工的に制御された条件下で細胞を培養し、自然環境ではなく、特に実験室環境で容易に培養できない種に対して、生物学的研究のための均一な実験材料を提供します。海洋無脊椎動物は全動物種1の30%以上を占め、再生2、3、ストレス応答4、環境適応5、6などの特定の生物学的プロセスの調節機構に関する研究を行うための多数の生物学的材料を提供する。

ナマコ、アポストコモスジャポニクスは、北太平洋沿岸の温帯水域に生息する最も研究されたエキノデルム種の一つです。東アジア、特に中国7では、商業的に重要な種として知られており、大規模にマリカルチャーされています。A.ジャポニクスに関する多くの科学的な質問は、死後8後の腸の再生の基礎となる調節機構および失神9の変性、代謝制御10、11、および免疫応答12、13熱ストレスまたは病原性ストレス下で、研究者の注目を集めている。しかしながら、よく研究されたモデル動物と比較して、基礎研究、特に細胞レベルに関する研究は、高度な細胞培養方法の欠如などの技術的なボトルネックによって制限される。

研究者は細胞株の確立に多くの努力を捧げてきたが、彼らはまた、多くの課題に直面しており、海洋無脊椎動物からの細胞株はまだ14を確立していない。しかし、海洋無脊椎動物からの一次細胞培養は、過去数十年で進歩した15、16、そして彼らは細胞レベルで実験する機会を提供している。例えば、A.ジャポニクスからの再生インテシンは、海洋無脊椎動物17の一次細胞培養のための実用的な方法を提供した長期細胞培養のための細胞源として利用されている。このプロトコルは、無脊椎動物細胞培養アプローチを組み合わせ、最適化し、ナマコまたは他の海洋無脊椎動物に広く適した一次培養方法を開発した。

アポトーシスは、様々な内因性および内因性刺激によって引き起こされる本質的な細胞自殺プログラムである。協調アポトーシスは、多くの生物学的システム18、19にとって極めて重要であり、そして、それは、アスティベーション9の間にナマコの腸の退行に関与している。目的の生物におけるアポトーシス過程を調べるために、Hoechst染色および顕微鏡アッセイを含む一連の方法が確立され、20を正常に適用した。ここでは、ナマコの一次培養腸細胞におけるアポトーシス誘導と検出を行い、海洋無脊椎動物の生物学的研究における一次細胞の使いやすさを評価した。一般的に使用される合成グルココルチコステロイド21の一つであるデキサメタゾンは、ナマコから培養腸細胞にアポトーシスを誘導するために使用され、有意なHoechst 33258シグナルは蛍光顕微鏡により染色細胞内で検出に成功した。

Protocol

1. 細胞培養培地調製 コロミック流体製剤 コロミック流体コレクション:滅菌条件下で、健康なナマコ(85〜105gの湿式重量)を解剖し、コエロミック液を採取し、滅菌ガラスフラスコに貯蔵する。 コロミック細胞除去:5分間1,700 x gで50 mL遠心管内のコロミック流体を遠心分離し、新しい滅菌ガラスフラスコに上清を移します。?…

Representative Results

ここでは、A.ジャポニクスの原発性腸細胞培養を確立し、細胞を通過させた。図1は、培養の異なる段階における丸い細胞を示す。そして、EdU染色アッセイは、後の段階でこれらの丸細胞の増殖活性を明らかにする直接的な証拠を提供する(図2)。我々はまた、濾過細胞の代わりに細分化された組織ブロックを培養し、プロトコルをわずかに調?…

Discussion

過去数十年にわたり、細胞株の確立に向けた広範な研究努力が行われてきましたが、海洋無脊椎動物14、22からの細胞の長期培養の進展はまだ困難です。ホロチュリアン組織の再生から培養した細胞は長期間生存し、増殖の高い活性が特定の細胞17、23で検出できることが報告されている。しかしながら、?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者たちは浙江大学のナイミング周教授の技術アドバイスと研究室の設備の利用に感謝したいと思います。この研究は、中国国立自然科学財団(補助金番号41876154、41606150、41406137)と浙江省の大学・研究機関のための基礎研究基金[補助金番号2019JZ00007]によって財政的に支えられた].

Materials

0.1 μm filter Millipore SLVV033RS
0.22 μm filter Millipore SLGP033RB
0.25% Trypsin Genom GNM25200
100 μm filter Falcon 352360
4 cm dishes ExCell Bio CS016-0124
4% paraformaldehyde solution Sinopharm Chemical Reagent 80096618 in PBS
Benchtop Centrifuges Beckman Allegra X-30R
BeyoClick EdU-488 kit Beyotime C0071S
CaCl2 Sinopharm Chemical Reagent 10005817
Constant temperature incubator Lucky Riptile HN-3
Dexamethasone Sinopharm Chemical Reagent XW00500221
Electric thermostatic water bath senxin17 DK-S28
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent 80176961 75%
Fibroblast Growth Factor(FGF) PEPROTECH 100-18B
Fluorescent microscope Leica DMI3000B DMI3000B
Garamycin Sinopharm Chemical Reagent XW14054101
Glucose Sinopharm Chemical Reagent 63005518
Hoechst33258 Staining solution Beyotime C1017
Insulin Sinopharm Chemical Reagent XW1106168001
Insulin like Growth Factor(IGF) PEPROTECH 100-11
KCl Sinopharm Chemical Reagent 10016308
Leibovitz's L-15 Genom GNM41300
L-glutamine (100 mg/mL) Genom GNM-21051
MgCl2 Sinopharm Chemical Reagent XW77863031
Na2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10020518
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308
NaOH Sinopharm Chemical Reagent 10019718
PBS Solarbio P1020 pH7.2-7.4
Penicillin-Streptomycin Genom GNM15140
PH meter Bante A120
Taurine SIGMA T0625
VE Seebio 185791

参考文献

  1. Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
  2. Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
  3. Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
  4. Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
  5. Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
  6. Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
  7. Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
  8. Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
  9. Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
  10. Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
  11. Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. 海洋生物学. 163 (8), 1-12 (2016).
  12. Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
  13. Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
  14. Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
  15. Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
  16. Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
  17. Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
  18. Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
  19. Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
  20. Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
  21. Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
  22. Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
  23. Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
  24. Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).

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記事を引用
Wang, T., Chen, X., Xu, K., Zhang, B., Huang, D., Yang, J. Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells. J. Vis. Exp. (155), e60557, doi:10.3791/60557 (2020).

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