概要

レンチウイルスベクターアプローチによるトランスジェニックラットの生成

Published: May 17, 2020
doi:

概要

本稿は、ザイゴテのペリビテリン空間へのウイルス懸濁液の複数の注射を用いたラット胚におけるレンチウイルストランスジェネシスの方法論を提供することを目的とする。異なる支配的な毛皮の色を持つ肥沃な男性株と交配される雌ラットは、偽妊娠の里親を生成するために使用されます。

Abstract

トランスジェニック動物モデルは、現代の生物医学研究にとって基本的に重要です。初期のマウスまたはラット胚への外来遺伝子の組み込みは、生物における遺伝子機能解析にとって非常に貴重なツールです。標準的な遺伝子導入法は、受精卵母細胞の原核に外来DNA断片をマイクロ注入することに基づいている。この技術はマウスで広く使用されていますが、他の動物種では比較的非効率的で技術的に要求が厳しいままです。この遺伝子は、レンチウイルス感染を介して1細胞段階の胚に導入することもできるので、特により困難な胚構造を有する種または株において、標準的な前核注射に代わる効果的な代替手段を提供する。このアプローチでは、レンチウイルスベクターを含む懸濁液を受精ラット胚の腹腔内空間に注入し、技術的に要求が少なく、成功率が高い。レンチウイルスベクターは、トランス遺伝子をゲノムに効率的に組み込み、安定なトランスジェニックラインの生成を決定することが示された。いくつかの制限(例えば、バイオセーフティレベル2要件、DNA断片サイズ制限)にもかかわらず、レンチウイルストランスジェネシスは迅速かつ効率的なトランスジェネシス法である。さらに、異なる支配的な毛皮の色を有する肥沃な男性株と交配される雌ラットを使用して、偽妊娠の里親を生成する代わりとして提示される。

Introduction

長年にわたり、ラットやマウスなどの実験室のげっ歯類は、ヒトの生理学的および病理学的状態をモデル化するために使用されてきました。動物研究は、他の手段では達成できなかった発見につながっています。当初、遺伝学的研究は、人間の状態を密接に模倣すると考えられている自然発生障害および型の解析に焦点を当てた1.遺伝子工学的手法の開発により、特定の遺伝子の導入または欠失が望ましい表現型を得ることが可能となった。そのため、遺伝子導入動物の生成は、生物における遺伝子機能の研究を可能にする現代研究の基礎技術として認識されている。

遺伝子導入動物技術は、実験発生学と分子生物学の成果を組み合わせて可能になりました。1960年代、ポーランドの発生学者A.K.タルコフスキは、開発初期段階におけるマウス胚操作に関する最初の研究を発表した。さらに、分子生物学者は、動物のゲノムに外来DNAを導入するためのDNAベクター(すなわち、キャリア)を生成する技術を開発した。これらのベクターは、選択した遺伝子の伝播と、実施される研究の種類に応じて、それらの適切な修飾を可能にします。「トランスジェニック動物」という用語は、ゴードンとラドル3によって導入された。

神経生物学、生理学、薬理学、毒物学、および生物医学と医学の他の多くの分野で使用された最初の広く受け入れられた種は、ノルウェーラット、ラトゥスノルベギカス4でした。しかし、ラット胚の操作が困難であるため、家のマウスの筋肉は、遺伝子研究5で支配的な動物種となっています。このような研究におけるマウスの優位性のもう一つの理由は、この種のノックアウト動物を生成する胚性幹細胞技術の利用可能性であった。トランスジェネシスの最も一般的に使用される技術(生まれたすべての動物に対するトランスジェニック子孫の2〜10%)は、受精卵母細胞の前核へのDNA断片のマイクロインジェクションです。1990年、マウスで初めて導入されたこのアプローチは、ラット66,77に適応した。前核注入によるラットトランスジェネシスは、マウスと比較して効率8が低いことを特徴とし、これは弾性プラズマおよび前核膜9の存在に厳密に関連している。操作後の胚の生存率はマウスより40〜50%低いが、この技術は遺伝子組み換えラット10の生成における標準と考えられている。効率的な導入遺伝子導入と注入された接合の高い生存率を保証できる代替アプローチが検討されている。

安定したトランスジーン発現と子孫への伝達の重要な決定要因は、宿主細胞ゲノムへの統合である。レンチウイルス(LV)は、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができるという特徴があります。異種遺伝子を胚に組み込むツールとしての使用は、高効率の11であることが判明し、トランスジェニック個体は、組み込まれたDNA断片の安定な発現によって特徴付けられる。レンチウイルスベクター,の有効性は、マウス12、13、ラット12、14、および他の,1311の遺伝子改変について確認されている。14この方法では、LV懸濁液は、2つの前核の段階で胚の透明帯下に注入される。この技術は、オイレンマが影響を受けないので、本質的に胚の100%生存を保証する。高品質で比較的集中度の高いLVサスペンションの製造は、重要な要素です。しかし、LV懸濁液の低濃度は、繰り返し注射11によって克服することができ、これは膜の集積に影響を与えずに卵表面でのウイルス粒子の量を増加させる。膜領域への反復注射を受けた胚はさらに発達し、トランスジェニック子孫は生殖細胞系列を介してトランスジーンを伝達することができる。レンチウイルストランスジェネシスによるトランスジェニックラット生成の効率は、80%12までも12高くすることができる。

ここでは、HIV-1由来組換えレンチウイルスの産生について、胞性口内炎ウイルス(VSV)Gエンベロープタンパク質を擬似タイプ型にした。第二世代のパッケージングシステムVSV疑似型の使用は、ウイルス粒子の広い感染性を決定し、超遠心分離および凍結保存によって濃縮することができる非常に安定したベクターの生産を可能にする。滴下検証後、ベクターはアルビノウィスターラットジゴテへのトランスジーンデリバリーの車両として使用する準備ができています。一連の注射の後、胚は一晩培養され、母親を育てるために2細胞段階で移すことができる。この時点で、2 つの代替アプローチのいずれかを検討できます。標準的な手順は、胎児のレシピエントとして疑似妊娠女性を利用する。しかし、精管切除された男性と交配した後に妊娠率が低い場合、胚は、暗い毛皮の色を有する肥沃な雄ラット(例えば、ブラウンノルウェー[BN]ラット)と交配している妊娠中のウィスター/スプレイグ・ドーリー(SD)メスに移植することができる。毛皮の色は、移された操作された胚に由来する子孫から自然妊娠からの子孫の区別を可能にする。

Protocol

ウイルスベクターの生産と適用は、バイオセーフティレベル2ガイドラインに従い、ポーランド環境省によって承認されました。以下に記載されているすべての実験動物の手順は、地方倫理委員会によって承認されました。動物は安定した温度(21-23 °C)および湿気(50-60%)で個別に換気されたケージに収容された12時間/12時間の明暗サイクルの下で水と食べ物へのアドリビタムアクセスで。 <p c…

Representative Results

本明細書に記載のプロトコルを用いて、Syn-TDP-43-eGFP構築物を運んだレンチウイルスベクターが産生され(物理LV力計=3.48x 10 8/μL)、次いで1細胞段胚下天注射に使用することができた。2つの目に見える前核を有する胚のみが処置に供された。ウイルス懸濁液の注射回数を実験的に決定した。高い移植効率とトランスジェニック子孫の同時欠如は、成功したトランスダクションのためのウ?…

Discussion

トランスジェニック技術の進歩により、げっ歯類モデルは生物医学研究において非常に貴重なツールとなっています。彼らは、生体内で遺伝子型-表現型の関係を研究する機会を提供する。ここでは、プロ核注射による従来のトランスジェネシスに対して広く利用可能な代替手段を提示する。レンチウイルス遺伝子導入の使用は、ウイルスベクターを透明帯下に注入することができるので、要…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、ポーランド科学財団のチームテックコアファシリティプラスプログラム内のANIMODプロジェクトによって支援され、欧州連合(EU)がWKに対して欧州地域開発基金の下で共同出資しました。

Materials

7500 Real Time PCR System Applied Biosystems
Aerrane (isoflurane) Baxter FDG9623
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA
Atipam 5 mg/ml Eurovet Animal Health BV N/A 0.5 mg/kg
Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin) Bayer N/A 5-10 mg/kg
Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15 Harvard Apparatus Limited 30-0039 injection capillary
Bupivacaine 25 mg/ml Advanz Pharma N/A 0.25% in  0.9% NaCl
Butomidor 10 mg/ml (butorphanol  tartrate) Orion Pharma N/A 1 mg/kg
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm Greiner Bio-One 627160
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm Greiner Bio-One 628160
CellTram Oil Eppendorf 5176 000.025
Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml cp-pharma N/A 0.5 mg/kg
Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin  Intervet N/A 150 IU/ ml ml 0.9% NaCl
DMEM low glucose Sigma Aldrich D6048
DNase, RNase-free A&A Biotechnology 1009-100
EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil Sigma ES-005-C
Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)  ADDGENE 14888
FemtoJet Eppendorf 4i /5252 000.013
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F9665-500ML
Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin  Intervet N/A 125 IU/ml in .9% NaCl
HEK 293T cells  ATCC ATCC CRL-3216
Hyaluronidase from Bovine Testis  Sigma H4272-30MG 0.5 mg/ml in M2 medium
Inverted Microscope  Zeiss Axiovert 200
Ketamine 100mg/ml Biowet Pulawy N/A 50 mg/kg
Liquid Paraffin Merck Millipore 8042-47-5
M16 medium EmbryoMax Sigma MR-016-D
M2 medium Sigma M7167
Magnesium Chloride 1M Sigma Aldrich 63069-100ML
Microforge Narishige MF-900
Mineral Oil Sigma M8410-500ML
NaCl 0.9% POLPHARMA OTC N/A sterile, 5ml ampules
Operation microscope  Inami Ophthalmic Instruments Deca-21
Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors  (delta R8.2 plasmid) ADDGENE 12263
PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,), Polysciences, Inc 23966-1
Penicilin-streptomycin Sigma Aldrich P0781-100ML
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma Aldrich 806552-500ML
Puller  Sutter Instrument Co. P-97
Reflex Clip Applier/Reflex Clips World Precision Instruments 500345/500346
Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads B.Braun Surgical 1048029
Stereomicroscope Olympus SZX16
Surgical Sewing Thread B.Braun  C1048040
SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystem 4334973
Tolfedine 4% (tolfenamic acid) Vetoquinol N/A 2 mg/kg
TransferMan NK2 Eppendorf N/A
Trypsin EDTA solution Sigma Aldrich T3924-500ML
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP 
VacuTip Eppendorf 5175108.000 holders capillary
Vita-POS Ursapharm N/A eye ointment
Warming Plate Semic N/A
Watchmaker Forceps VWR 470018-868

参考文献

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記事を引用
Koza, P., Przybyś, J., Klejman, A., Olech-Kochańczyk, G., Konopka, W. Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach. J. Vis. Exp. (159), e60570, doi:10.3791/60570 (2020).

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