幹細胞移植、膣内ヒト免疫不全ウイルス暴露、液滴デジタルPCR RNAを用いたヒト化免疫不全ウイルス感染NOGマウスモデルの生成と評価のためのプロトコルを開発しました。定量化。
ヒト化マウスは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ウイルス学を研究し、抗ウイルス薬をテストするための洗練されたプラットフォームを提供します。このプロトコルは、成人NOGマウスにおけるヒト免疫系の確立について述べている。ここでは、ヒトCD34+細胞に由来する臍帯血の単離とその後の静脈内移植から、HIV感染によるモデルの操作、組み合わせ抗レトロウイルス療法まで、すべての実用的なステップを説明する。cART)、および血液サンプリング。約75,000hCD34+細胞がマウスに静脈内注射され、ヒトキメラリズムのレベル(ヒト化とも呼ばれる)は、末梢血中にフローサイトメトリーによって数ヶ月間縦方向に推定される。合計75,000 hCD34+細胞は、末梢血中の20%~50%のヒトCD45+細胞を生み出します。マウスはHIVによる膣内感染の影響を受けやすく、血液は分析のために毎週1回、長期間にわたって毎月2回サンプリングすることができる。このプロトコルは、液滴デジタルPCR(ddPCR)を用いた血漿ウイルス負荷の定量法について説明する。我々は、マウスが食事中の標準的なcARTレジメンで効果的に治療する方法を示す。通常のマウスチャウの形でのcARTの送達は、実験モデルの重要な改良である。このモデルは、全身性および局所的な曝露前予防化合物の前臨床分析、ならびに新規治療およびHIV治療戦略の試験に使用することができる。
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、世界中で3700万人以上の感染者を有する慢性感染である1.併用抗ウイルス療法(cART)は救命療法であるが、治癒はまだ保証されている。したがって、HIVの継続的な研究を促進するために、ヒト免疫系とその応答を反映した動物モデルが必要である。ヒト細胞を重度免疫不全マウス2に移植することにより、ヒト化マウスの複数のタイプが開発されている。このようなヒト化マウスはHIV感染の影響を受けやすく、非ヒト霊長類シミアン免疫不全ウイルスモデルに代わる重要な代替手段を提供し、非ヒト霊長類よりも安価で使いやすい。ヒト化マウスはHIVウイルス感染、病因、予防、および治療3、4、5、6、7、8、9、10、11の研究を促進している。
コード血液由来ヒト幹細胞をNODマウスに移植して開発したHIV研究用の柔軟なヒト化モデルシステムを紹介する。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) 背景。非胎児起源であることに加えて、これらのマウスの実用的なバイオエンジニアリングは、血液肝胸腺(BLT)構築物の移植に関与する微小外科的処置に比べて技術的に厳しくない。
我々は、膣内感染を通してHIV感染を確立する方法と、敏感な液滴デジタルPCR(ddPCR)ベースのセットアップで血漿ウイルス負荷を監視する方法を示す。その後、毎日のマウス食生活の一部として与えられる標準cARTの確立について述べます。これらの組み合わせ方法の目的は、動物へのストレスを軽減し、各動物の取り扱いに費やす時間が制限される大規模な実験を促進することである12。
ヒトでは、CCR5Δ32/wtまたはCCR5Δ32/Δ32遺伝子型が原因で、トランスミッタ/ファウンダーウイルスによるHIV感染に対する感受性が低下し、HIV研究の目的でヒト化マウスを幹細胞でバイオエンジニアリングする際には、いくつかの予防措置を講じる必要があります。CCR5遺伝子に天然の変異体、特にΔ32欠失が世界14、15の他の部分と比較してスカンジナビアおよびバルト諸国のネイティブ集団でより一般的であるため、これは私たちの地域で特に当てはまります。したがって、我々のプロトコルは、移植前にCCR5変異体のドナー造血幹細胞をスクリーニングするための容易で高スループットのアッセイを含む。
膣内暴露のために我々は、送信機/創設者R5ウイルスRHPA4259を選び、感染の初期段階で女性から隔離され、感染した16.我々は、マウスの大部分で正常な伝達を得るのに十分であるが、100%透過率を下回るウイルス用量にマウスを曝露した。このような用量を選択すると、薬物候補の抗ウイルス効果がHIV予防実験で保護動物をもたらし、治療研究のためのウイルス負荷が低下するような伝達率において十分なダイナミックレンジが可能になる。
重度の免疫不全マウス株NOD。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac(NOG)は、ヒトの細胞および組織の移植に非常に適しています。これらのマウスの自然免疫経路と適応免疫経路の両方が損なわれる。NOGおよびNSGマウスは、TおよびB細胞機能に欠陥をもたらすPrkdcScid突然変異を有する。さらに、これらのマウスは、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、およびIL-21などの?…
The authors have nothing to disclose.
著者らは、オーフス大学の生物医学動物施設のスタッフ、特にジャニ・ケア氏のコロニー維持活動とマウスの体重追跡に感謝したいと考えています。著者らは、標準的なcARTを開発し、指導してくれたフロリアン・クライン教授に感謝したいと思います。NIHエイズ試薬プログラム、エイズ部門、NIAID、NIHを通じて、ジョン・カペス博士とクリスティーナ・オクセンバウアー博士からpRHPA.c/2635(cat#11744)を用いて、以下の試薬を入手しました。
Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
Flowjo v.10 | |||
Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
Heating lamp | Custom made | ||
Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
Mouse restrainer | Custom made product | ||
Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
Proteinase K | NEB | 100005398 | |
QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
Trypane blue | Sigma | T8154 | |
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |