クロマチン免疫沈降と次世代シーケンシング(ChIP-seq)は、転写因子とそれらが制御するゲノム配列との間の相互作用を確立するために使用される方法です。このプロトコルは、例としてサルモネラ腸管セロバーチピムリウム細菌バイオフィルムを使用して、細菌バイオフィルムでChIP-seqを行うための技術を概説する。
クロマチン免疫沈降の後にシーケンシング(ChIP-seq)は、転写因子、ヒストン修飾、およびその他のDNA関連タンパク質の調節標的を発見するために使用できる技術です。ChIP-seqデータは、異なる環境条件または細胞型における転写因子の微分結合を見つけるためにも使用することができる。当初、ChIPはマイクロアレイ(ChIPチップ)上でハイブリダイゼーションを介して行われました。しかし、ChIP-seqは、技術の進歩、シーケンシングに対する金融障壁の減少、および大量の高品質なデータ出力を通じて好ましい方法となっています。持続的および慢性感染の主要な供給源である細菌バイオフィルムを用いてChIP-seqを行う技術は、このプロトコルで説明されている。ChIP-seqは、サルモネラ腸管セロバーチピムリウムバイオフィルムおよびプランクトン細胞に対して行われ、マスターバイオフィルムレギュレータCsgDを標的とし、2種類の細胞における微分結合を決定する。ここでは、収穫するバイオフィルムの適量を実証し、プランクトニック対照試料に正規化し、クロスリンカーアクセス用のバイオフィルムを均質化し、高品質なシーケンシング結果を得るための日常的なChIP-seqステップを実行する。
細菌バイオフィルムは、自己産生マトリックスに埋め込まれた細胞の構造集合体、乾燥、抗生物質、および宿主免疫応答1に対して耐性である。そのため、持続的および慢性的な感染症を引き起こし、生存と伝染に対する解決策により、研究者に固有の課題を提示します。サルモネラ・エンテロル・チフィムリウム (S.チフィム尿)は、乾燥および抗生物質に耐性を有するバイオフィルム凝集体のフェノ典型的異種集団、および環境ストレスにさらされたときに純粋培養における毒性因子を発現するプランクトン細胞(28°、栄養制限)2を確立することが分かった。これら2種類の細胞は、マスターバイオフィルムレギュレータの不安定発現により生じる、CsgD3.我々は、これは、プランクトニック細胞が短期伝達に関与し、バイオフィルム細胞が新しい宿主に感染する機会が生じるまで環境中で長期的に持続することができるサルモネラ菌のベットヘッジ戦略であるかもしれないという仮説を立てている。csgオペロン発現を制御する規制要素の多くは、5を十分に特徴付けている。しかしながら、adrAおよびcsgオペロン6を除いて、CsgDの規制標的はほとんど知られていない。CsgD規制ネットワークを特定することは、サルモネラのライフサイクルとバイオフィルムが伝送において果たす役割をよりよく理解するのに役立ちます。
クロマチン免疫沈降の後にハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)は、タンパク質-DNA相互作用のゲノム全体の同定のための強力なインビボ技術であり、転写因子、ヒストン修飾、またはヌクレオソーム7を含む調節過程に関する情報を提供する。新しい研究は、成長条件と細胞タイプ8との間の微分タンパク質結合を評価するために、この技術を使用しています.クロマチン免疫沈降(ChIP)では、相互作用タンパク質を含むDNA断片が標的タンパク質の抗体選択を通じて濃縮されます。細胞は採取され、DNA結合タンパク質はホルムアルデヒド架橋剤治療を通じて生体内のDNAに架橋されます。細胞は、細胞の内容物を放出し、クロマチンは約200〜600bp断片7にシアリングされる。標的タンパク質に結合したDNA断片は、抗体を用いて免疫沈降され、続いてタンパク質消化9を脱架化して単離する。これらのDNA断片は、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション(ChIPチップ)またはゲノム配列10、11への深いシーケンシングおよびマッピングによって一致するタンパク質結合部位を表す。ChIPチップ実験は十分な規制データを生み出しますが、高価なプローブの使用、ハイブリダイゼーション、アレイバイアス12などにより制限されています。ChIP-seqは、ヌクレオチド分解能とカバレッジの増加、信号対雑音比の向上、およびChIPチップ7と比較した場合のアーティファクトの減少により、より大きなダイナミックレンジを有する。
ChIPは、サルモネラ・セロバー・ティフィムリウム13、14、ビブリオ・アルギノリティクス15のクォーラムセンシングAphA調節、エシェリヒアにおけるRpoS規制におけるSfhおよびOmpR調節を分析するために使用されている coli16,結核菌における毒性調節器EspR調節17,シュードモナス・エルギノーサ18におけるAmrZ調節を介した潜在的なジグニン酸シクラーゼ, ならびにVraSR黄色ブドウ球菌の調節19.記載されている細菌ChIP-seq実験は、液体媒体中の細胞の増殖と単一細胞形態での収穫から始まります。しかし、バイオフィルムの解析とそれに対応する遺伝子調節は、成功したChIP-seqプロトコルを生成するための新たな課題のセットを表しています。このプロトコルでは、ChIP-seqはCsgD、Sの差動規制ターゲットを見つけるために使用されます。バイオフィルムおよびプランクトニック細胞型におけるチフィムリウムマスターバイオフィルムレギュレータ。このプロトコルは、ChIP-seqに適量のバイオフィルムを決定し、フラスコ培養からバイオフィルムを収穫し、バイオフィルムおよび単一細胞対照試料を正規化し、バイオフィルムを均質化し、完全な免疫沈降を行うために使用される技術を記述します。これは、細菌バイオフィルムの調節ターゲットを研究するのに有用であり、多くの種に適応することができます。
このプロトコルは、サルモネラ腸管セロバルチピムリウムバイオフィルムおよびプランクトニック細胞を用いてChIP-seqを行う技術を概説し、マスターバイオフィルムレギュレータCsgDの調節目標を見つける。2種類の細胞におけるCsgDの二重安定性による微分結合情報が期待され、バイオフィルム凝集体が高く、プランクトニック細胞2、3のレベルが低いと期待される。しかし、この技術は、他の細菌転写因子、細胞型、または増殖条件にも適用することができる。特に、この技術は、バイオフィルム細胞の単位重量当たりのCFUに対して実験的に決定された変換因子を用いて他の細菌バイオフィルムに適合させることができる。
ChIP-seqは、シーケンスによって技術的なエラーの増幅を受けやすいことができます。ただし、重要な手順で確認すると、この27を防ぐことができます。一次抗体特異性は、免疫沈降7の際に制御する標的転写因子およびDNAのみを選択するために重要である。この実験では、csgDを遺伝子の3’末端でプラスミドコード3xFLAGタグに融合し、CsgD22のC末端に対応した。csgDを含まないp3xFLAGプラスミドを「対照」(S.)として用いた。タイフィム尿 14028 ≥csgD + p3xFLAG).ENCODEガイドラインは、目的のタンパク質に対して一次抗体を用いて免疫ブロットを行い、ChIP株および欠失株21の溶解物を行う。転写因子結合および下流シーケンシング結果の変動性を低減するために、反復間で増殖条件が一貫していることを確認することが重要です。1つは、接種サイズとプレ接種の成長条件が一貫していることを確認するために注意している場合,フラスコ培養におけるバイオフィルムの成長は一貫している4.均質化後にすべてのバイオフィルムが分解されたことを確認し、試薬、特にホルムアルデヒド架橋剤からすべての細胞への平等なアクセスを確保することが重要です。
いくつかの改変により、研究者は他のDNA結合タンパク質、細胞型、株、増殖条件、またはラボ機器にこのプロトコルを使用することができます。S以外のバイオフィルム形成種に用いられる場合。Typhimuriumは、バイオフィルムの単位重量当たりのコロニー形成単位の変換因子を実験的に決定する必要があり、バイオフィルムの異なる量を収穫し、バイオフィルムを完全に均質化し、連続希釈およびプレートカウントを行って標準的な曲線を作成し、これはより低いバイオフィルム重量2では正確ではないかもしれない。超音波処理器のエネルギー移動と細胞タイプの抵抗は異なる場合があります。したがって、超音波発生は、下流のライブラリの準備とシーケンシング11に必要なフラグメントサイズの範囲を生成する超音波処理バーストの数を見つけることをお勧めします。マイクロコッカルヌクレアーゼによるクロマチン断片化は、占有部位の高解像度を生成する超音波処理に代わるものである。ただし、この方法では断片化バイアスが7,28に生じる可能性があります。DNAサイズの範囲は、下流のライブラリ準備キットとシーケンシングプラットフォームに応じて変更される場合があります。均質化の他の方法は、ミキサーミルの代わりに使用され得る。例えば、ガラス組織ホモジナイザーは置換され得るが、バイオフィルムをエアロゾル化または不完全に分解することがある。対照の観点から、前免疫沈降DNAは、シーケンシング後の処理および分析において正規化することができる。種一致正常抗体血清を有するモックIP制御は、13と同様に対照として使用することができる。
研究者は、ChIP-seq実験を検討する際に、この方法の制限を考慮する必要があります。他のバイオフィルムタイプに適応するために重要な改変が必要な場合があります。例えば、PBSにおけるバイオフィルムのサルモネラ・チフィムリウム即時再懸濁液は、バイオフィルム凝集体の測定可能な損失につながる。細菌の転写因子の調節因子を標的とする免疫沈降は、非常に少量のDNAをもたらす可能性があり、これは後の段階での精製および検出のための課題である。バイアスは、ライブラリ検出9の間にせん断および下流操作中に導入することができる。さらに、この方法は、転写因子結合に応答して生体内発現レベルを明らかにしない。バイオインフォマティクスの経験がほとんどない研究者は、分析パイプラインに挑戦するかもしれません。このメソッドは、時間がかかり、コストがかかる場合があります。しかし、シーケンシングのコストはマイクロアレイよりも低いことが多く、技術の改善が続く中で時間の経過とともに減少しています。
文献中の少数の方法は細菌を用いたChIPを記述し、ほとんどの細菌実験は単純な増殖条件13、14、15、17、18から始まる。単一細胞によるChIPサンプル調製は簡単であり、バイオフィルム凝集体を用いたChIPサンプル調製よりも少ない課題を提示する。ChIP-seqに関しては、指数濃縮(SELEX)によるリガンドの系統的進化を含むシス調節回路を研究する以前の方法、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、ChIPチップ、プロモーター欠失およびレポーター分析が補完またはChIP-seq29に置き換えられている。ChIP-seqは、技術の進歩とシーケンシングの可用性により、ChIPチップを置き換えています。ディープシーケンシングは、ChIPチップ11、30よりも少ない開始材料で結合親和性が低く、ベースペア分解能が高いサイトを識別できる膨大な量のデータを研究者に提供します。高品質の基準ゲノムを持つ生物からのChIPデータの分析は、一般的に高速かつ特異的です。さらに、ChIP-seqは、すべての細胞タイプ、増殖期、または環境条件31において占有されない可能性のあるシリコ予測結合部位で発見するための徹底的な方法である。
将来的には、このプロトコルは、細菌病因、特にバイオフィルム形成生物の理解を容易にするために使用することができる。この技術の広範な採用と新しいデータセットの利用可能性は、バイオフィルム形成微生物32における細胞プロセスを制御するために共局在するタンパク質のグループを同定するためのデータ統合につながる可能性がある。さらに、ChIP-seqおよびRNA-seqデータを統合して規制システムモデル33を構築することができます。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、自然科学工学研究会議(NSERC)(#2017-05737)からAWへの助成金とバイオテクノロジーのヤリスロウスキー議長の助成金によって支援されました。MPは、サスカチュワン大学の感染症、食品安全、公共政策(ITraP)の統合トレーニングプログラムを通じてNSERC-CREATE奨学金によって支援されました。
著者たちは、撮影と編集をしてくれたダニ・デールに感謝したいと思います。
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |