植物形態素遺伝子は、再生成遺伝型の遺伝子変換を改善するために使用することができる。ここに記載されているのは、3つの重要な公共トウモロコシ近交線のためのアグロバクテリウム媒介遺伝形質転換(QuickCorn)プロトコルである。
ここで実証されたアグロバクテリウム媒介性遺伝子の近交線の形態形成遺伝子ベビーブーム(Bbm)とWuschel2(Wus2)を使用した間近線の詳細なプロトコルである。Bbmは、トウモロコシリン脂質トランスファーゼ遺伝子(Pltp)プロモーターによって調節され、Wus2はトウモロコシオーキシン誘導性(Axig1)プロモーターの制御下にある。これらの形態形成遺伝子を移動DNA(T-DNA)に搭載するアグロバクテリウム株とアグロバクテリウム病原(vir)遺伝子の余分なコピーは、未熟な胚のトウモロコシに感染するために使用されます。体細胞性胚は、感染した胚のスキューテラ上に形成され、除草剤耐性によって選択され、植物に発芽することができる。DNAコンストラクトに組み込まれた熱活性化cre/loxP組換えシステムにより、形質転換プロセスの初期段階でトウモロコシゲノムから形態素遺伝子を除去することができます。このプロトコルを使用して、W22、B73、Mo17に対して、約14%、4%、および4%(感染した100個の感染した胚当たりの独立したトランスジェニック事象の数)の変換頻度をそれぞれ達成することができる。
形質転換は、トウモロコシの外来遺伝子発現を評価し、研究と商業目的の両方で遺伝子組み換えトウモロコシラインを生産するための基本的なツールです。高スループット変換へのアクセスは、トウモロコシ分子および細胞生物学研究の必要性の増加を促進することができます1.作物種を遺伝的に変換する能力は、公立および民間の両方の研究所にとって不可欠です。これにより、遺伝子調節メカニズムの基本的な理解と、増え続ける人口を支える地球規模での作物改善の両方が可能になります。
トウモロコシからの未熟な胚が生殖可能なカルスの産生に使用できるという発見は、1975年2年に始まった。この啓示以来、ほとんどのスケーラブルなトウモロコシ変換プロトコルは、再生3の前にカルスの形成と選択を必要としてきました。遺伝的形質転換の過程で、アグロバクテリウム感染または生物的爆撃を受けた未熟胚は、胚発生カルス誘導のために培地上で培養される。誘発されたカリは、選択的培地(例えば、除草剤を含む)で培養され、変換されたカルス片だけが生き残ることができるようになる。これらの除草剤耐性推定トランスジェニックカリは、増量され、植物に再生されます。この方法は有効ですが、プロセスは長く、労働集約的であり、4を完了するのに3ヶ月以上かかることがあります。さらに重要なことに、従来のトウモロコシ変換プロトコルははるかに大きな制限を有し、すなわち、限られた数のトウモロコシ遺伝子型のみが5,6に変換できる。
Lowe et al.7,8は、変換プロセスの期間を大幅に短縮するだけでなく、変換可能な遺伝子型のリストを拡張した “QuickCorn” 変換方法を以前に報告しました。クイックコーン法は、赤対数転写因子ベビーブーム(BBM)9およびWUS(WUS)10のトウモロコシオルソログ(Zm-BbmおよびZm-Wus2)を利用する。形質転換ベクター系に組み込まれると、これらの遺伝子は、胚発生成長を刺激するために相乗的に働く7。
この作品で説明したQuickCornプロトコルはジョーンズら11のプロトコルに基づいており、Lowe etal7,8によって報告された方法のさらなる改善であった。本研究では、バイナリベクトル構造PHP81430(図1)とアクセサリープラスミドPHP7153912を有するアグロバクテリウム株LBA4404(Thy-)を変換に使用している。PHP81430のT-DNAには、以下の分子成分が含まれています。(1)形質転換選択的マーカー遺伝子Hra発現カセット。このトウモロコシのフラ(Zm-Hra)遺伝子は、スルホニル尿素およびイミダゾリノン類などのALS阻害除草剤に耐性のあるアセトルラクターゼ(ALS)遺伝子を13、14に変更した。Zm-Hra遺伝子はソルガムALSプロモーター8およびジャガイモプロテイナーゼ阻害剤II(ピンII)ターミネータ15によって調節される。T-DNAには、(2)形質スクリーンマーカー遺伝子ZsGreenを有する発現カセットも含まれる。この緑色蛍光タンパク質遺伝子ZsGreenはゾアンサスspサンゴ礁16から、ソルガムユビキチンプロモーター/イントロンおよび米ユビキチンターミネーターによって調節される。
また、T-DNAには(3)形態素性遺伝子Bbm発現カセットが含まれる。Bbmは、胚発生9、17に関連する転写因子である。Bbmは、トウモロコシリン脂質トランスファーーゼタンパク質(Pltp)プロモーター8および米T28ターミネーター18によって調節される。Zm−Pltpは、胚スキュテラー上皮、絹毛、および葉子会社細胞(ガード細胞に隣接する)において強い発現を有する遺伝子であり、生殖器官における低発現、および根8における発現がない。また、(4)形態素遺伝子Wus2発現カセットを含有する。Wus2は、尖部メリステム19の維持に関連する別の転写因子である。Zm-Wus2は、トウモロコシオーキシン誘導性プロモーター(Zm-Axig1)20およびトウモロコシIn2-1ターミネーター21の制御下にある。最後に、T-DNAは(5)cre-loxP再結合系を含む。 また、cre recombinase遺伝子22は、トウモロコシ熱ショックタンパク質17.7(Hsp17.7)23プロモーター及びポテトピンIIターミネーターの制御下にある。2つのloxP部位(同じ向き)24はZsGreen、cre、BbmおよびWus2を含む4つの遺伝子発現カセットを隣接する。
形態形成遺伝子の存在は植物の成熟とその後の子孫には望まれていないため、熱誘発性cre-loxP組み換えシステムがT-DNAに組み込まれ、正常なカルスの再生と植物の発達を可能にするためにトウモロコシゲノムから形態形成遺伝子を除去しました。熱処理の際、CREタンパク質の発現は、Hra選択遺伝子を除くすべての遺伝子のトランス遺伝子を除去する。成功した形質転換体は除草剤耐性であるべきであるが、ZsGreen-陰性である。形質転換頻度をさらに高めるために、アグロバクテリウム株はまた、アグロバクテリウム病原(vir)遺伝子12の余分なコピーを有する追加の付属プラスミド(PHP71539)を収容する。
QuickCornメソッドは、変換中にカルス誘導ステップを伴わないため、従来のトウモロコシ変換プロトコルとは異なります。アグロバクテリウム感染後の最初の週に、体細胞胚は感染した未熟な胚のスキュテーラー上皮に発生する。その後、胚は胚の成熟と芽形成を促すホルモンを持つ培地に移される。体細胞胚を急速に成熟/撃つ形成媒体に移すため、トウモロコシの形質転換に以前に使用されていた伝統的なカルス段階をスキップし、T0植物8の直接生成を可能にする。以前に公開されたトウモロコシ変換法6と比較して、QuickCorn法はより速く、より効率的で、より少ない遺伝子型依存である。この方法を使用して、根付いた植物は、通常、従来のプロトコルで必要とされる3ヶ月以上ではなく、わずか5〜7週間で土壌に移す準備ができています。この記事の目的は、この方法の詳細な説明とデモンストレーションを提供し、ほとんどの学術機関で一般的に見られる実験室の設定で簡単に複製できるようにすることです。
トウモロコシ変換のための伝統的なプロトコルは、未熟な接合性胚を単離してトランスジェニックカルス組織を生成するというパラダイムに従い、これは肥沃な植物4、6に再生される。これは効果的ですが、カルスベースのプロトコルは時間がかかり、組織培養プロセスが植物を生産するのに最大3ヶ月かかることがよくあります。ここで提示された方法が重要なのは、コールスフリーで効率的で迅速であり、約半分の時間枠でT0植物の再生を可能にすることです。また、遺伝子型依存性が低いように見えるので、ほとんどの公的に入手可能な近親交配8,11に有効です。
すべての手順を効果的に実行する必要がありますが、成長メディアの正しい準備が不可欠です。成長培地成分は、植物材料が化学物質の適切な濃度を受け取ることを確実にするために、前と後の両方のオートクレーブの正しい段階で添加する必要があります。これは、抗生物質のような敏感な化合物が分解しないことを保証します。また、プロトコルに示すように、各段階で植物材料を正しい成長培地に配置することも重要です。適切な成長媒体に材料を置かないと、物質的な死を引き起こす可能性があります。さらに、あまりにも多くの胚を置くか、プレート上の組織を開発することは避けるべきです。2倍の組織片を置くことは、化学物質やペトリ皿(さらにはインキュベータースペース)のコストを節約することができますが、過密プレート内の組織の成長は深刻に阻害される可能性があります。感染を行う間、アグロバクテリウム懸濁液の光学密度が適切であることを保証すべきである。細菌懸濁液密度が低すぎると、適切な感染が起こらない可能性があります。
出発材料の品質は、変換プロトコルの成功に不可欠です。胚解剖に使用される耳は健康でなければならず、それらを産生する植物は健康であることを意味する。彼らはまた、適切な種子セットを所有し、害虫や無病でなければなりません。また、古いアグロバクテリウムは使用しないでください。「母」プレートは生後2週間以下でなければなりません。この時点で、新しい実験を開始するために、新しい「母」プレートをストリークする必要があります。
この方法は、より少ない遺伝子型依存であることが示されているが、すべての行が等しく成功するとは考えられない。使用されているコンストラクトに基づく成功の違いだけでなく、ライン間の変動が依然として存在する可能性があります。未熟な胚を扱う場合、耳から耳への変動も避けられないので、理想的には複数の耳を使ってこれを考慮する必要があります。この研究では、近交配W22が最高のパフォーマンスを発揮し、〜14%以上の変換頻度で、次いでB73とMo17(各約4%)が続いた。Loweら8は、B73およびMo17変換のためのクイックコーンプロトコルを使用して報告した。この作業では、変換周波数はB73の場合は9%から50%、Mo17では15%~35%の範囲でした。
この研究で観察されたB73およびMo17の低い変換周波数の1つの可能性は、季節的な耳の品質変動に起因する可能性がある。Loweら8のこの作品との違いは、ここで異なるベクトル構築物が使用された点です。ロウの研究では、形態素遺伝子は形質転換された植物から取り除かれたのではなく、後の段階で発達的に沈黙した。この研究では、形態素遺伝子は感染後8日後に除去された。B73とMo17は、体細胞胚の発生のためにBbm / Wus2のより長い存在を必要とする可能性があります。
この方法を用いて、非トランスジェニックエスケープ植物、多量体挿入、および非興奮性トランスジーンを得る可能性がある。これらの植物は顕著に異なる表現型を有しないので、PCRによる検出は、植物がトランスジェニックであるかどうかを判断するために必要とされます。これを達成するために、切除領域内のPCRプライマーおよび切除領域に隣接するプライマーを採用することができる。複数の独立した形質転換は、同じ未熟な胚から植物を産生することもできるので、全独立形変容体の回復速度の決定は困難である。私たちの基準は、植物を生産した各未熟胚から1つの植物をサンプリングし、これを感染した胚の数で割ることに基づいて形質転換率を計算することでした。この方法は、プラントレットとして回収された独立したイベントの実際の数をほぼ確実に過小評価しています。同じ胚からの独立した事象間の差別は、トランスジーンの周りの境界領域をシーケンシングする必要があり、これはほとんどのアプリケーションにとって非常に高価で時間がかかります。ただし、これらのデータが役立つ場合もあります。
この組織培養変換の方法は非常に有効であることが証明されていますが、問題は依然として発生する可能性があります。植物材料が応答しない場合、特定の近交線に問題がある可能性があり、成長培地組成やサブカルリングのタイミングなどの変数が調整を必要とすることを示唆している。元のベクトルが変更された場合、もう一つの変数は、適切なベクトル設計と正確なベクトル構築です。いくつかのラインは他のものよりも敏感であり、イマザピルの濃度は正常に形質転換された植物を達成するために調整する必要があるかもしれないので、イマザピル感受性にも問題があるかもしれません。
過去30年間で、トウモロコシ組織培養および形質転換プロトコルは変化し、進歩してきました。この短縮されたプロトコルは、この進行をさらに進めると考えられています。この方法は、従来の方法よりも時間がかからず、学術的な設定に有効です。また、高度な訓練を受けたオペレータを要求しないため、従来の方法と比較して広範囲に分布することがより適しています。今後、この方法はゲノム工学などの新しい技術と組み合わせることができます。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、トウモロコシの未熟な耳を提供してくれたコルテバ温室チーム、メディアを作るための支援を提供するためのコルテバメディア準備ラボ、アグロバクテリウム構造の助けを求めてコルテバからニンワン、アイオワ州立大学のキューサブ・リーに支援を提供してくれたことに感謝します。このプロジェクトは、国立科学財団植物ゲノム研究プログラムがK.W.に1725122と1917138を与え、予測植物フェノミクス研究研修プログラム(国立科学財団グラントDGE-1545453)からJ.Z #IOW04341.に部分的に支援されました。
2,4-D | Millipore Sigma | D7299 | |
6-Benzylaminopurine (BAP) | Millipore Sigma | B3408 | |
Acetosyringone | Millipore Sigma | D134406 | |
Agar | Millipore Sigma | A7921 | |
Aluminum foil | To cover the flask | ||
Ammonium Sulfate | Millipore Sigma | A4418 | |
Analytical balance | To weigh small quantities of chemicals | ||
Autocalve | Primus (Omaha, NE) | PSS5-K | To autoclave media and tools |
Bacterial culture loop (10 µl) | Fisher scientific | 22-363-597 | Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid |
Bactoagar | BD bioscience | 214030 | |
Beakers (1 L, 2 L, 4 L) | To mix the chemicals for media | ||
Benomyl | Millipore Sigma | #45339 | |
Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) | Clorox | For seed sterilization | |
Boric Acid | Millipore Sigma | B6768 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | |
Carbenicillin | Millipore Sigma | C3416 | |
Casein Hydrolysate | Phytotech | C184 | |
Cefotaxime | Phytotech | C380 | |
Conical tube (50 mL) | Fisher scientific | 06-443-19 | Contain liquid medium and Agro suspension |
Cuvette (Semi-micro) | Fisher scientific | 14955127 | To hold liquid for measuring OD |
Dicamba | Phytotech | D159 | |
Digital hygrometer | Checking temperature and humidity for heat treatment | ||
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Millipore Sigma | 324503 | |
Eppendorf tube (2.0 mL) | ThermoFischer Scientific | AM12475 | |
Eriksson's Vitamins | Phytotech | E330 | 1000x in liquid |
Ethanol (70%) | Sterilizing tools and surfaces | ||
Ferrous Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | F8263 | |
Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 | ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) | A903206 | Fertilizer |
Flask (2 L) | Pyrex | 10-090E | To autoclave media and tools |
Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) | Hummert International (Earth City, Mo) | 11300000 | Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome |
Forceps (fine-tipped and large) | Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders | ||
Gentamicin | Gold Biotechnologies | G-400 | |
Glass bottle (1 L) | Pyrex | 06-414-1D | To autoclave medium |
Graduated cylinder | To adjust volume of media | ||
Imazapyr | Millipore Sigma | 37877 | |
Incubator, 20 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection |
Incubator, 27 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow co-cultivation plate and maize embryo culture |
Incubator, 45 °C | Heat shock treatment | ||
Insert TO Standard, pots | Hummert International (Earth City, Mo) | 11030000 | For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome |
Laminar flow hood | Maintains sterile conditions | ||
L-proline | Phytotech | P698 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | M1880 | |
Maize inbred seed B73 | U.S National Plant Germplasm | id=47638 | |
Maize inbred seed Mo17 | U.S National Plant Germplasm | id=15785 | |
Maize inbred seed W22 | U.S National Plant Germplasm | id=61755 | |
Manganese Sulfate Monohydrate | Millipore Sigma | M7899 | |
Milli-Q Water purification systems | Millipore sigma | MILLIQ | For tissue culture grade water |
MS Basal Medium | Millipore Sigma | M5519 | |
MS Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | M5524 | |
N6 Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | C1416 | |
Paperclips, non-skid | Holding on tassel bags | ||
Peptone | BD bioscience | 211677 | |
Petri dish (100×15 mm) | Fisher scientific | FB0875713 | For bacteria culture medium |
Petri dish (100×25 mm) | Fisher scientific | FB0875711 | For the plant tissue culture medium |
pH meter | Fisher scientific | AB150 | To adjust pH of media |
Pipette (1 mL) | ThermoFischer Scientific | 4641100N | |
Plastic Boxes | The Container Store | 10048430 | For tissue culture storage and incubation |
Plastic humidy dome (Humi-Dome) | Hummert International (Earth City, Mo) | 14385100 | Plastic cover for soil flat |
Potassium Iodide | Millipore Sigma | 793582 | |
Potassium Nitrate | Millipore Sigma | P8291 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Millipore Sigma | P5655 | |
Scale | To weigh chemicals for media | ||
Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) | Thermo Scientific | 3120030 | remove the top of the kernel crowns for embryo dissection |
Scalpel handle | Holding scalpel blades | ||
Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) | Phytotech | S826 | 100x powder |
Scissors | Cutting ear shoots | ||
Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) | Seedburo (Des Plaines, IL) | S26 | Semi-transparent bag to cover ear shoots |
Silver Nitrate | Millipore Sigma | S7276 | |
Sodium Molybdate Dihydrate | Millipore Sigma | M1651 | |
Soiless substrate LC1 | SunGro Horticulture (Agawam, Ma) | #521 | For growing maize plants |
Spatula (Double Ended Micro-Tapered) | Fischer Scientific | 2140110 | Dissecting embryos from kernels |
Spatula (with spoon) | Fisher scientific | 14-375-10 | To measure chemicals for media |
Spectinomycin | Millipore Sigma | S4014 | |
Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) | Thermo Scientific | 840-300000 | Measure OD of Agro suspension |
Stirring bar | Fisher scientific | 14-513-67 | To mix media |
Stirring hotplates | To mix media | ||
Syringe (without needle, 60 mL) | Fisher scientific | 14-823-43 | For filter sterilization |
Syringe filter (0.22 µm) | Fisher scientific | 09-720-004 | For filter sterilization |
Tassel bag (Canvasback- brown) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514 | Bag to cover tassels of non-transgenic plants |
Tassel bag (Canvasback-green stripe) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514G | Bag to cover tassels of transgenic plants |
Thiamine HCl | Phytotech | T390 | |
Thidiazuron | Phytotech | T888 | |
Thymidine | Millipore Sigma | T1895 | |
Timentin | Phytotech | T869 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | Cas #9005-64-5 | surfactant |
Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI0236 | Homogenizes liquids (Agro suspension) |
Water bath (large – Precision model 186) | Fisher scientific | any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C | Keeps autoclaved media at optimal temperature |
Weigh dish | Fisher scientific | 08-732-112 | To measure chemicals for media |
Weighing paper | Fisher scientific | 09-898-12A | To measure chemicals for media |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP14222 | |
Zeatin | Millipore Sigma | Z0164 |