概要

フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化

Published: May 24, 2020
doi:

概要

本プロトコルでは、ヒト多能性幹細胞からの神経節後交感神経ニューロンの生成に対する安定した、高効率な分化戦略を説明する。このモデルは、複数の自律神経障害の研究の使用のためにニューロンを利用可能にします.

Abstract

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、疾患のモデル化やヒト胚発生の研究に役立つツールとなっています。我々は以前、自律神経障害患者に適用された交感神経を有する自律神経ニューロンの誘導のための分化プロトコルを提示した。しかし、このプロトコルは、ノックアウト血清置換(KSR)およびフィーダーベースの培養条件に基づいて構築され、高い分化効率を確保するために、細胞のソートが必要であった。これらの要因は、高い変動性、高コスト、および低い再現性を引き起こします。また、成熟した交感神経特性は、電気的活性を含めて、検証されていない。ここでは、PSC培養と分化がフィーダーフリーで化学的に定義された培養条件で行われる最適化されたプロトコルを提示する。幹神経堤を識別する遺伝子マーカーが同定される。ポストガンリオニック交感神経ニューロンへのさらなる分化は、細胞のソートを必要とせずに20日後に達成される。電気生理学的記録は、機能的ニューロン同一性をさらに示す。我々の分化されたニューロンから検出された発火はニコチンによって増強され、アドレナリン受容体拮抗薬プロプラノロールによって抑制することができる。このプロトコルにおける中間交感神経前駆物質は、最大2週間のニューラルスフェロイドとして維持することができ、培養の拡大を可能にする。要約すると、私たちの更新された交感神経分化プロトコルは、以前のバージョンと比較して、高い分化効率、より良い再現性、より柔軟性、およびより良い神経成熟を示しています。このプロトコルは、自律神経系に影響を与える人間の障害を研究するために必要な細胞を研究者に提供します。

Introduction

神経節後交感神経ニューロン(symN)は自律神経系(ANS)に属し、意識から独立した身体の恒常性の応答および調節において複数の重要な役割を果たしています。例えば、ストレスはsymNを刺激し、心拍数、血圧、発汗の増加につながる戦いや飛行応答を呼び起こします。SymNは、遺伝学、毒性/傷害、または他の疾患の仲間として、複数のヒト障害に影響を受けます。遺伝的神経障害の一例は、小児期障害家族性自律神経障害(FD)であり、symNの重度の調節不変が自律神経障害を引き起こし、発汗、皮膚のしみ、嘔吐発作、高血圧、および不安1によって明らかである。毒性の一例は化学療法治療であり、自律神経細胞に毒性の副作用があると報告されている2.自律神経性脱化および超内腎症は、パーキンソン病または高血圧性腎疾患,3,4などの疾患に併生したり、併生したりすることが知られている。このように、疾患の文脈におけるsymN生物学や欠陥のメカニズムを研究し、理解できることは、新しい効果的な治療法の探索に有益である。

解剖 学
末梢神経系は、感覚と自律神経分裂に分岐します。感覚神経系の感覚神経は痛みや触覚の原因ですが、ANSはすべての臓器から脳への情報を中継する責任があります。ANSは腸神経系に分かれており、胃腸管を内面化し、リラクゼーションに重要な副交感神経系、および器官の活性化/調節に重要な交感神経系(SNS)に分かれています。SNSは、2ニューロンシステム5を適応させる。脊髄の前神経節交感神経軸索は、神経節後のsymN細胞体が位置する交感神経節に最初に投影される。これらのニューロンは、その後、体内のすべての臓器の標的組織を内側に向けるために長い投影を送信します。前ガングリオン性ニューロンによって伝達される信号はコリン作動性であるのに対し、ポストガングlionic symNはアドレナリン性であり、したがってノルエピネフリン(NE)を主な神経伝達物質として発現する。コリン作動性であるポストガンリオニック、交感神経ニューロンの顕著な例外はほとんどありません, 血管を内在するものを含みます.アドレナリン性ポストガングLION細胞は、酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ(AAAD)、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ(DBH)、モノアミンオキシダーゼ(MAO-A)を発現し、NEの生成と代謝を担います。さらに、NE循環性トランスポーターおよび/または受容体αアドレナリン受容体(ADRA2)、βアドレナリン受容体(ADR2B)、ノルエピネフリントランスポーター(NET1)、およびベスキュリモノアミントランスポーター(VMAT1/2)を発現する。

開発
胚発生時にsymNは神経堤(NC)に由来し、神経管とエクトダーム6を重ね合わせ、メラノサイト、骨芽細胞、椎細胞細胞、グリア、腸腸ニューロン、感覚ニューロン、自律神経ニューロン7を含む複数の細胞系統に分化することができる。神経堤細胞(NCC)は、胚を通るいくつかの経路を取る高度に回遊性細胞である。NCの開発の初期のこの段階では、細胞はマーカーSNAIL1 / 2、FOXD3、およびSOX10898、9、10、1110,11を表します。,移行ルートと、それらが採用する軸方向の位置によって、それらが開発される NC サブタイプが決まります。これらのNCサブタイプは、その特定のHOX遺伝子発現によって区別することができる:頭蓋NCCはHOX遺伝子を発現しない、迷走NCCはHOX 1-5を発現し、トランクNCCはHOX 6–9を発現し、仙骨NCCはHOX 10-1112を発現する。その中でも、トランク NCC は symN の主なソースとして認識されます。SymN前駆体は、転写因子MASH1/ASCL113を発現し、これは、PHOX2B14およびINSM115の発現を促進する。15転写因子のGATAファミリーは、後期交感神経発達中に発現される。GATA2 と GATA3 は symN で表現され、DBH16がアクティブになります。転写因子 HAND2 は、DBH および TH17の発現および維持のためにも重要です。

HPSC(例えば、胚性および誘導多能性幹細胞)は、発達パラダイムを再現し、種々のヒト障害の疾患モデリングに使用できるsymNを生成する強力なツール18である。したがって、hPSCからsymNを生成する際には、発達ガイドラインに従い、分化プロセスに沿って適切なマーカーの発現を評価することが重要です。

以前の symN プロトコル
これまでに hPSC19,20,,21から symN の生成を報告した研究グループはほとんどありません。20これらのプロトコルを相互に直接比較し、我々のプロトコルは、最近22を見直した。2016年23年には、symN文字を持つ自律神経細胞の生成のための分化プロトコルを発表しました(図1A)。このプロトコルは、未分化hPSCと細胞分化の両方で使用されたKSRベースの培地を使用しました。さらに、hPSCはマウス胚性線維芽細胞(MEFフィーダー細胞)上に維持された。我々は、障害23をモデル化するためにFD患者からこのプロトコルとPSCを採用しました.2019年には、この古いプロトコル24のより詳細なバージョンを説明しました。要約すると、神経運命は、最初の2日間でTGF-βおよびBMPシグナル伝達を遮断するために二重SMAD阻害25によって誘導された。CHIR99021を用いたWNT活性化は、神経前駆物質をNC細胞に昇格させた。11日目、細胞はCD49D++またはSOX10+集団26、23に対してFACSによってソートされ23約40%のNC生成効率をもたらした。+したがって、分化の次のステップのための効率と純度を確保するためにソートが必要であった。NccはFGF2とCHIRの併用処理により、スフェロイドとして維持および増幅された。4日後、メンテナンスのNCスフェロイドをメッキし、BDNF、GDNF、およびNGFを与え、symN成熟を終了した。これらのsymNはASCL1、TH、DBH、およびPHOX2Aなどの強力なsymNマーカーを発現したが、ニコチン性アセチルコリン受容体(CHRNA3/CHRNB4)および小胞輸送体(VMAT1/2)の発現を含む、より成熟したsymNのマーカーは、70日後の分化後も低かった。このプロトコルのHOX遺伝子は正式に試験されておらず、細胞の電気生理学的活性を含む成熟した神経特性は検証されなかった。

ここでは、symN を生成するための最適化されたプロトコルを示します (図 1B)。HPSC は、エッセンシャル 8 (E8) メディア27を使用して、ビトロネクチン (VTN) コーティングされた皿のフィーダーフリー条件で維持されます。分化媒体の式は各段階で修正されており、NC母集団28の割合を増加させる。symN成熟はCD49D+/SOX10+ソートまたはソートされていないバルクNCC集団で行うことができます。どちらも30日目までに高レベルのsymNマーカー表現を示す。さらに、このプロトコルで生成されたsymNは、電気生理学的記録およびsymN活性化剤および阻害剤化合物を用いた治療に応答する。

Protocol

注意: H9 PHOX2B:GFPレポーターラインは、Ohららによって提供されました。この論文で使用されるいくつかのqPCRプライマーは、OriGene Technologiesから得られたもので、いくつかの配列はFrithら,、30から得られる。20 1. 食器のコーティング、メディアの準備、および hPSC メンテナンスのためのセットアップ ディ?…

Representative Results

このプロトコルでは、hPSC から symN を生成する方法について説明します。ここで示した培養条件は、以前に公開されたプロトコル23,24 (図 1A) からフィーダーフリーで化学的に定義された条件まで改善されました (図 1B)。2 つのオプションがあり、1 つは 20 日以内に symN を作成し、もう 1 つは NCC を 2 週間?…

Discussion

我々は最近、2つのレビューを発表し、1つは、疾患モデリング31のためのhPSC由来のsymNの使用を議論し、利用可能な分化プロトコル22の詳細な比較を行った。そこで、興味のある研究者がsymNを作ることに成功するために、現在のプロトコルのトラブルシューティングに焦点を当てます。分化プロセス全体の間、一貫したデータと健康な分化細胞を得るために?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ハイジ・ウルリッヒスの原稿の批判的な読み取りと編集に感謝します。

Materials

100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-DAPI antibody Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

参考文献

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記事を引用
Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

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