概要

チラピア湖ウイルスの特異的かつ迅速な検出のための逆転写ループ媒介等熱増幅(RT-LAMP)アッセイ

Published: May 18, 2020
doi:

概要

従来のRT-PCR技術と比較して比較的短時間で簡単な機器を使用したティラピア魚のTiLV検出用RT-LAMPアッセイを発表します。このプロトコルは、特に発展途上国において、TiLVDの流行の広がりを制御するのに役立つ可能性がある。

Abstract

ティラピア湖ウイルス病(TiLVD)は、ティラピア湖ウイルス(TiLV)によって引き起こされるチラピアの新興ウイルス病であり、世界の多くの地域でティラピアの大量罹患率と死亡率をもたらした養殖業における永続的な課題です。TiLV感染に対する効果的で迅速かつ正確な診断アッセイは、初期感染を検出し、養殖農業における病気の蔓延を防ぐために必要です。本研究では、魚類組織におけるティラピア湖ウイルスを検出するために、高感度かつ実用的な逆転写ループ媒介等温増幅法(RT-LAMP)法を発表した。感染したサンプルのRT-qPCRとRT-LAMPアッセイの比較は、63(100%)で肯定的な結果を明らかにしましたおよび 51 (80.95%)それぞれサンプル。さらに、感染していないサンプルの分析は、全63の未感染組織がRT-qPCRおよびRT-LAMPアッセイの両方に否定的な結果をもたらすことを示した。ティラピアの5つの病原体との交差反応性をRT-LAMPを用いて評価し、すべての試験は否定的な結果を示した。感染した魚から得られた肝臓と粘液の両方のサンプルは、RT-LAMP法を使用して同等の結果を示し、粘液は魚を殺すことを避けるために非致死的なアッセイとしてRT-LAMPで使用できることを示唆した。結論として、この結果は、提示されたRT-LAMPアッセイが1時間以内にティラピア組織におけるTiLV検出に有効な方法を提供することを実証した。したがって、この方法は、TiLVの迅速な診断のための農場でのスクリーニングツールとして推奨されます。

Introduction

ティラピア湖ウイルス病(TiLVD)は、アジア1、2、アフリカ、アメリカを含む世界の多くの地域でティラピアの死亡を引き起こすと伝えられているティラピア(1,オロークロミス属)のウイルス性疾患です。この病気は、2009年にイスラエルでティラピアの大量死亡時に初めて認められ、キネレット湖の野生のティラピアの数は年間257トンから8トンに劇的に急落した。この疾患は、チラピア湖ウイルス(TiLV)によって引き起こされ、これは、新しい属ティラピネウイルスおよび新種ティラピアチラピネウイルス3としてアムヌーンウイルス科に割り当てられている。TiLVの遺伝的特徴付,けは、ウイルスが10タンパク質,1、2、4をコードする10個のセグメントを有する新規なエンベロープ、陰1性感覚、一本鎖RNAウイルスであることを示した。4セロロドン属のティラピアの様々な種、オレオクロミスおよびティラピンおよび他の温水魚(例えば、巨大なグーラ(オスフロネムス・ゴラミー))はTiLV2,55の影響を受けやすいことが示2されている。現在、このウイルスは、感染した生きた魚66、77の動きを通じて世界的に広がり続けているが、凍結チラピアまたはその製品を介したウイルス感染のリスクは8に制限されている。TiLV感染による実質的な死亡率は、ティラピア産業に著しく有害な経済的影響を及ぼす可能性がある。例えば、TiLV感染に伴うエジプトにおける夏の死亡率症候群の経済的影響は、1億米ドル9と計算されたしたがって、養殖場におけるこの病気の管理を容易にする迅速かつ適切な診断方法を開発することが重要である。

これまでTiLVDの診断は、分子アッセイ、ウイルス分離、組織病理学に基づいていました。TiLV診断10,11,11用に異なるPCRプロトコルおよびプライマーが開発されている。例えば、ウイルスの検出感度を有するSYBRグリーンベースの逆転写定量PCR(RT-qPCR)法が開発され、TiLV検出10のために検証されている。TiLV 検出の他の PCR 法としては、TaqMan 定量 PCR11、RT-PCR2、入れ子になった RT-PCR12、および半ネスト RT-PCR13が挙げられます。しかし、これらの方法は、反応の複雑さのために結果を生み出すために洗練された実験室機器と比較的長い時間を必要とし、フィールドアプリケーションには適していません。

ループ媒介アイソ熱増幅(LAMP)アッセイは、迅速でシンプルで実用的な分野アプリケーション14,15,15です。この技術はストランド変位反応の原理を採用し、増幅反応は洗練された高価なサーマルサイクラー14,15,15を使用せずに等温条件下で実行される。その結果、増幅されたLAMP製品またはRT-LAMP製品は、DNAまたはRNA14の安全な可視化または濁度または白い沈殿物,16、17、18,17の存在のために肉眼で観察するための蛍光染色を有するアガロースゲル電気泳動を用いてラダー状のバンドで分析される。18これらの理由から、この技術は、異なる魚病原体,,,17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27のオンサイト検出に使用されています。20,21,22,17,18,19,26,27232425本研究の目的は、TiLV検出のための迅速で敏感で正確なRT-LAMPアッセイを確立することであった。RT-LAMPアッセイは30分以内に魚のサンプルのTiLVのためのスクリーニングを提供する。この技術はTiLVDの診断および監視のために適用されるかもしれない。

Protocol

この実験は、動物組織の使用を含む、カセサート大学、バンコク、タイの施設動物の世話と使用委員会によって承認されました (プロトコル番号ACKU61-VET-009). 1. 組織の収集 クローブオイルの過剰摂取(すなわち、3 mL/L以上)を使用してティラピア魚を安楽死させる。トリケインメタンスルホン酸塩は、クローブオイルの代替として使用することができる。 滅?…

Representative Results

本研究では、ティラピアにおけるTiLV感染を検出するためのRT-LAMPアッセイが開発された。試験されたサンプルは、2015年から2016年の間にタイの異なる地域にある14の農場から収集されました。感染した魚と感染していない魚は、主に物理的な診断と症候性TiLVDの出現に基づいてグループ化されました。TiLV感染は、その後、回収プロセス後にRT-PCRを用いて確認された。ランプアンプリコンの評価?…

Discussion

養殖産業は、継続的に実質的な経済的損失引き起こすウイルス感染によって脅かされています9,23,,28.例えば、新興TiLVは、世界の多くの地域でティラピア生産国に大きな脅威を与えています1,,6,9.これまで、TiLVDを予防するための特定の治療法はありま?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロジェクトは、タイの高等教育研究推進・国立研究大学プロジェクトの下、タイの高等教育研究基金(TRF)助成金番号RDG6050078と農業・食品先端研究センター、バンコク、タイの高等教育研究推進と国立研究大学プロジェクトの下で、タイの教育研究委員会のオフィス、タイの教育委員会のオフィスで資金を提供しています。研究の一部は、カセサート大学大学院大学院大学院奨学金によって支援されています。著者たちは、ビデオの物語を話してくれたクワンラウィー・シリカンチャナ博士と、ビデオを編集してくれたピヤウォッチアラ・シカリンに感謝したいと思います。

Materials

Tissue collection:
Clove oil Better Pharma N/A
Tricaine methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) ThermoFisher Scientific Corp. 15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) Geneaid GZR100
Direct-zol RNA Kit: Zymo Research R2071
– Direct-zol RNA PreWash
– RNA Wash Buffer
– DNase/RNase-free water
– Zymo-spin IIICG columns
– Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction buffer Biotechrabbit BR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich 7487-88-9
dNTP set Bioline BIO-39053
Betaine Sigma-Aldrich B2629
Calcein mixture Merck 1461-15-0
Bst DNA polymerase Biotechrabbit BR1101301
AMV reverse transcriptase Promega M510A
Nuclease-free water Invitrogen 10320995
Elite dry bath incubator, single unit Major Science EL-01-220
Gel electrophoresis:
Agarose Vivantis Technologies PC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer Sigma-Aldrich SRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
– Tris Vivantis Technologies PR0612-1KG
– Acetic acid (glacial), EMSURE Merck Millipore 1000632500
– Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec Sigma-Aldrich V800170-500G
Neogreen NeoScience Co., Ltd. GR107
DNA gel loading dye (6X) ThermoFisher Scientific Corp. R0611
DNA ladder and markers Vivantis Technologies PC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) Bio-Rad 1704487
PowerPac HC power supply Bio-Rad 1645052
Gel Doc EZ System Bio-Rad 1708270
UV sample tray Bio-Rad 1708271
NαBI imager Neogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT Kit Toyobo FSQ-101
Viva cDNA Synthesis Kit Vivantis Technologies cDSK01 An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) ThermoFisher Scientific Corp. ND-2000
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725120
Nuclease-free water, sterile water MultiCell 809-115-CL
8-tube PCR strips, white Bio-Rad TLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, optical Bio-Rad TCS0803
CFX96 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1855196
General equipment and materials:
Mayo scissors N/A
Forceps N/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer) Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60 LioFuge CM610
Corning LSE mini microcentrifuge Corning 6765
Pipettes Rainin Pipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tips Quality Scientific Plastics TF series
Corning Isotip filtered tips Merck CLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST Wuxi NEST Biotechnology 615601

参考文献

  1. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  2. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  3. Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
  4. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
  5. Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
  6. Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2017).
  7. Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
  8. Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
  9. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
  10. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  11. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
  12. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  13. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
  14. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
  15. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
  16. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
  17. Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
  18. Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
  19. Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
  20. Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
  21. Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
  22. Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
  23. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
  24. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
  25. Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
  26. Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
  27. Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
  28. Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. 発生生物学. 121, 255-261 (2005).
  29. Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
  30. Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
  31. Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
  32. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  33. Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
  34. Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
  35. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
  36. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  37. Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
  38. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  39. Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).

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記事を引用
Phusantisampan, T., Rawiwan, P., Roy, S. R. K., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus. J. Vis. Exp. (159), e61025, doi:10.3791/61025 (2020).

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