概要

自動冷凍工場におけるクライオグラインによる細胞抽出物の調製

Published: January 29, 2021
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概要

タンパク質の分解や変性を最小限に抑える極低温冷凍工場を用いて、酵母や他の細胞から全細胞抽出物を調製するための信頼できる方法を説明します。細胞抽出物は、機能性タンパク質複合体の精製、プロテオミクス分析、共免疫沈降試験、不安定タンパク質修飾の検出に適しています。

Abstract

遺伝子操作の容易さと出芽酵母 サッカロミセスセレビシエ における真核細胞機械の強力な進化的保全は、それを著名な遺伝モデル生物にしました。しかし、効率的なタンパク質の単離は細胞の最適な破壊に依存するため、細胞タンパク質の生化学的分析のための酵母の使用は、酵素的に消化するのに高価な細胞壁(リチケースまたはジモリアーゼを使用)によって妨げられ、サンプルの加熱を引き起こすことなく機械的に破壊することは困難です(伝統的なビーズビーター、フランスのプレスまたはコーヒー粉砕機を使用して)。乳鉢と害虫を使用した液体窒素(LN2)下の酵母細胞の手動粉砕はサンプルの過熱を避けますが、作業集約的であり、オペレータ間の細胞のリシスの変動を受けます。長年にわたり、自動冷凍工場で細胞の凍結粉砕を用いた高品質酵母エキスの調製に成功してきました。LN2 を用いて達成した-196 °Cの温度は、タンパク質、核酸および他の高分子の検索を可能にする、プロテアーゼおよびヌクレアーゼによる分解から生物学的材料を保護する。ここでは、LN2 への液滴添加を通じてライシスバッファー内の細胞の懸濁液を最初に凍結し、「ポップコーン」と呼ばれる細胞の凍結液滴を生成することを含む出芽酵母細胞について詳細に説明する。このポップコーンは、冷凍工場でLN2 の下で粉砕され、ゆっくりと解凍され、難解な破片を除去するために遠心分離によって明確化された凍結した「粉末」抽出物を生成します。得られた抽出物は、タンパク質または核酸の精製、プロテオミクス分析、または共免疫沈降試験などの下流の用途に対応できます。この技術は、様々な微生物、植物および動物組織、サンゴを含む海洋標本、ならびに法医学および永久凍土化石標本からDNA/RNAを単離する細胞抽出物に広く適用される。

Introduction

酵母は、研究者が利用できる遺伝的および生化学的ツールが豊富にある単純な真核生物であるため、タンパク質研究に人気のモデル生物です。その頑丈な細胞壁のために、研究者が直面する1つの課題は、細胞の内容物を損なうことなく細胞を効率的にlysすることです。酵素リシス(zymolyase)2、3、化学液化4、凍結融解による物理的な液化5、圧力ベース(フレンチプレス)6、7、機械(ガラスビーズ、コーヒーグラインダー)8、超音波処理ベース10および低温2、11を含む酵母細胞の破壊を介してタンパク質抽出物を得るために利用可能な異なる方法が利用可能である。細胞のリシスの効率およびタンパク質収量は、使用される技術によってかなり異なり、したがって、ライセートの所望の下流アプリケーションの最終的な結果または適合性に影響を与える。不安定なタンパク質、翻訳後修飾のタイミング、または温度に敏感なタンパク質を研究する場合、調製中のサンプル損失や分解を最小限に抑える方法を使用することが特に重要です。

抽出準備技術 詳細 利点 欠点 ダウンストリーム解析 参照
フランスのプレス:ザイモリャーゼを使用した酵素処理による高圧ホモジナイザー(別名マイクロフルダイザー) ザイモリアーゼ-20T、マイクロ流体化用高圧ホモジナイザー。ディスラプターは、空気駆動式高圧ポンプ(比1:250;必要な空気圧0.6-l MPa)と、追加のバックプレッシャーユニットを備えた特別な破壊室で構成されています。処理には、最小サンプルサイズ20 mLが必要です。 結合されたプロトコルを使用して得られた最終的な全破壊は、Zymolyaseなしで均質化のみを使用して95 MPaで4パスで32%の破壊と比較して、95 MPaの圧力で4パスで100%に近づいた。 小規模アプリケーションには適していません。酵素は、大規模な準備のために高価になる可能性があります。 タンパク質精製 6
ビーズビーター:Zymolyase処理された細胞は、高速準備器具でガラスビーズで固着 ほぼ同量の冷たい乾燥した酸洗浄0.5mmガラスビーズが、リシスバッファー内の所定の量の細胞ペレットに添加され、細胞は激しい手動攪拌によって破壊される。 タンパク質精製のためではなく、アッサンの目的のために、多くの異なる小さな酵母培養物からの抽出物を作る場合に特に有用である。 ガラスビーズの手順の間に、タンパク質は、タンパク質の変性につながる広範な発泡を引き起こす過酷な処理されます。細胞破断の量はさまざまですが、タンパク質の変質は機械的破損時に4°C以上の抽出物を加熱した結果として生じる可能性があります。 主にDNAとRNAの分析だけでなく、ウェスタンブロッティングの有無にかかわらず、ゲル電気フェオレシスを変性することによってタンパク質分析も行います。 8
続いて、浸透性ショックとDounce均質化の組み合わせを用いたリシスによるジモリアーゼ治療 細胞壁の酵素消化後、球状体は、Dounceホモジナイザーで15〜20ストロークの密着性害虫(クリアランス1〜3μm)でリセ化されます。 BJ926やEJ101などのプロテアーゼ欠損株を用いることが有利である。これは、酵母細胞を破壊する最も穏やかな方法であり、したがって、複雑な酵素機能(例えば、翻訳、転写、DNA複製)を行うことができる抽出物を調製し、高分子構造(例えば、リボソーム、スプライスソーム)の完全性を維持する必要がある。クロマチン研究(ブルームとカーボン、1982)や核タンパク質抽出物(LueとKornberg、1987)に使用できる無傷の核を単離するのにも有用です。 スフェロプラストのライシス手順の主な欠点は、特に大規模な調製物(>10リットル)では比較的面倒で高価であり、長いインキュベーション期間はタンパク質分解またはタンパク質修飾につながる可能性がある。 クロマチン製剤の場合、それらは(ヌクレオソームはしごの完全性に基づいて)差動遠心によって生成されるものよりも変化するか、または低い品質であるように見える。 クロマチン研究のために無傷核を分離し、複雑な酵素機能を実行できる抽出物、完全性を必要とする抽出物
高分子構造、核タンパク質抽出物
2
乳鉢/乳棒またはブレンダーを使用して液体窒素を粉砕することにより、フラッシュ凍結細胞の細胞破壊 細胞は液体窒素で直ちに凍結し、次いで、乳鉢で手動で粉砕するか、液体窒素の存在下でワーリングブレンダーを使用して溶菌する。 プロトコルは迅速かつ簡単です。それは非常に大きい培養物を含む酵母細胞の様々な量を収容できる。その主な利点は、細胞が積極的に成長している状態から液体窒素(−−196°C)にすぐに取られ、プロテアーゼやヌクレアーゼなどの分解酵素活性が低下し、タンパク質(例えば、ホスファターゼおよびキナーゼ)を修飾する活性である。これは、大規模なタンパク質精製のための単一の酵母培養物から全細胞抽出物を作るのに特に適しています。 不注意な捜査官にとって少し乱雑で潜在的に危険です。小さいサンプル(すなわち、10〜100ml酵母培養)は、ブレンダーで効果的に破壊するのに十分な凍結細胞塊の塊の質量がないため、容易に処理されない。個々のサンプルを処理し、使用間に機器をきれいにすることは時間がかかります。 大規模なタンパク質精製のための単一の酵母培養物からの全細胞抽出物。 2
オートリシス、ビーズミル pH 5.0、 50 °C、 24 時間、 200 rpm / Ø 0.5 mm、 5 × 3 分/3 分 迅速かつ効率的なリシス、特に小規模な抽出物の調製 熱の生成は、高分子の変性と分解につながります。ビーズの打ち装置が必要です。 小規模分析。 10
自動起き、超音波処理 pH 5.0,50°C,24時間,200rpm,4×5分/2分,パルサー80%,パワー80% 超音波処理装置は、通常、ほとんどの機関で利用可能です。 熱の生成は、高分子の変性と分解につながります。超音波処理装置が必要です。遅いリシスは24時間以上かかることがあります。 酵母細胞壁製剤。
沸騰および凍結解凍プロセス 標準の冷凍庫と暖房ブロックまたは温水風呂以外に特別な設備は必要ありません。 効率的、再現性、シンプルで安価。 熱の生成は、高分子の変性と分解につながります。 PCRによるDNA分析。 5

表1:酵母エキスの調製に利用可能な方法の比較。

極低温粉砕(別名極低温粉砕/極低温粉砕)は、定量的または定性的な分析のために信頼性の高い方法で温度に敏感なサンプルから核酸、タンパク質または化学物質を取り出すために一般的に使用されます。バイオテクノロジー、毒物学、法医学12、13、環境科学、植物生物学14、食品科学など、さまざまな分野での複数の用途に成功しています。無傷の生体高分子の単離は、通常、温度に重大に依存する。非常に低い温度は、プロテアーゼとヌクレアーゼが不活性のままであることを保証し、その後の分析のために無傷のタンパク質、核酸および他の高分子の信頼できる単離をもたらす。実際、冷凍工場は通常、-196 °C(LN2の沸点)のサンプル温度を維持し、DNA/RNAまたはタンパク質の変性および分解を最小限に抑えます。

冷凍工場は、ステンレス鋼のエンドプラグ間で粉砕されるサンプルを含むバイアル内で固体金属バーまたはシリンダーを迅速に前後に移動する電磁粉砕室を採用しています。この装置は、粉砕チャンバー内の磁場を作成し、迅速に反転させます。磁場が前後にシフトすると、磁石はプラグに対してサンプルを押しつぶし、「クライオグラインディング」とポップコーンの粉砕を達成します。フリーザーミルは乳鉢と害虫を置き換え、複数のサンプル(または最大4個の小さいサンプルを同時に)の順次処理を可能にし、手動研削に伴うユーザー間の変動を回避します。サンプルが処理されると、セル抽出物をさまざまなダウンストリーム アプリケーションに使用できます。

Protocol

1. 酵母ポップコーンの調製 YPD培地の0.5 Lで酵母細胞を1 x 107 細胞/mLの密度に成長させます。コールターカウンターまたはその他の手段を使用してセルをカウントします。 遠心分離細胞を2,400gおよび4°Cで10分間用いた。 500mLの氷冷脱イオン18メガオームミリQ水で各サンプルを1回洗います。 氷冷リシスバッファーの15 mLでペレットを再懸濁する [20 mM HEPES-KOH …

Representative Results

酵母細胞のリシスの2つの異なる方法、すなわち4°Cのガラスビーズ粉砕と-196°Cの自動凍結粉砕法を比較し、両方の方法で調製された細胞抽出物中の相対的な回復タンパク質を評価した。この研究のために、私たちは出芽酵母株YAG 1177(MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2:ura3 ubi3-Δub-を使用することを選択しました。 2 ubi4-Δ2:::LEU2 [pUB39] [pUB221])<sup…

Discussion

酵母由来の天然タンパク質の研究の限界は、その硬い細胞壁による酵母細胞の非効率的なリシスである。いくつかの方法が開発されていますが、私たちの手の中で最も一貫した効率的な方法は、ポップコーンとして凍結された酵母細胞の凍結粉砕です。この方法は、他のリシス法と比較して出芽酵母からの高品質の全細胞抽出物の信頼性の高い調製を可能にする。代表的な結果は、クリオグ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

グンジャン研究所の研究は、国立衛生研究所、国立科学財団、フロリダ州保健省からの資金によって支援されています。学部生のジョン・パーカーに技術支援を感謝します。

Materials

50 mL polycarbonate tubes with screw caps Beckman 357002 Centrifuge tubes
BD Bacto Peptone BD Biosiences 211677 Yeast YPD media component
BD Bacto Yeast Extract BD Biosiences 212750 Yeast YPD media component
Beckman Avanti centrifuge Beckman B38624 High speed centrifuge
Beckman JLA-9.1000 Beckman 366754 Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydrous MP Biomedicals 901521 Yeast YPD media component
Eppendorf A-4-44 Eppendorf 22637461 Swinging bucket rotor
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R Eppendorf 22625101 Refrigerated centrifuge
Glycerol SIGMA-ALDRICH G5150-1GA Volume excluder and cryoprotectant
HEPES FisherBiotech BP310-100 Buffer
HIS6 antibody Novagen 70796 Antibody for HIS tag
KCl SIGMA-ALDRICH P9541-1KG Salt for maintaining ionic strength
MG-132 CALBIOCHEM 474790 Proteasome Inhibitor
Phosphatase inhibitor cocktail ThermoFisher Scientific A32957 Phosphatase inhibitor cocktail
Ponceau S SIGMA P7170-1L Protein Stain
Protease inhibitor cocktail ThermoFisher Scientific A32963 Protease inhibitor cocktail
Rotor JLA 25.500 Beckman JLA 25.500 Rotor
Sodium Butyrate EM Science BX2165-1 Histone Deacetylase Inhibitor
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S6521 Phosphatase Inhibitor
Sodium Vanadate MP Biomedicals 159664 Phosphatase Inhibitor
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar 13408-09-8 Phosphatase Inhibitor
Spex Certiprep 6850 freezer mill SPEX Sample Prep 6850 Freezer Mill
TALON Metal Affinity Resin BD Biosiences 635502 For pulling down HIS tagged proteins
Tween 20 VWR International VW1521-07 Non-ionic detergent
β-Mercaptoethanol AMRESCO M131-250ML Reducing agent

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記事を引用
Phillips, E. O. N., Giovinazzi, S., Menz, S. L., Son, Y., Gunjan, A. Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill. J. Vis. Exp. (167), e61164, doi:10.3791/61164 (2021).

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