概要

組織サンプルの質量分析ベースのショットガンプロテオミクスの包括的ワークフロー

Published: November 13, 2021
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概要

記載されたプロトコルは、ラベルベースとラベルフリー定量の2つのアプローチを用いて、組織サンプルの最適化された定量プロテオミクス分析を提供します。ラベルベースのアプローチは、より正確なタンパク質定量の利点を有する一方で、ラベルフリーアプローチはより費用対効果が高く、コホートの何百ものサンプルを分析するために使用されます。

Abstract

質量分析の最近の進歩は、堅牢で再現可能なデータセットの生成と共に深いプロテオミクス分析をもたらしました。しかし、かなりの技術的進歩にもかかわらず、患者の血液、CSF、および組織などの生体検体からのサンプル調製は依然としてかなりの課題を抱えています。バイオマーカーを同定するために、組織プロテオミクスはしばしば、研究結果をベンチから診療所に翻訳する魅力的なサンプル源を提供する。これは、アルツハイマー病、パーキンソン病などの癌や神経変性疾患の早期診断のための潜在的な候補バイオマーカーを明らかにすることができます。組織プロテオミクスはまた、タンパク質の豊富に基づいて全身情報の富を生成し、興味深い生物学的な質問に対処するのに役立ちます。

定量的プロテオミクス解析は、ラベルベースとラベルフリーアプローチの2つの大きなカテゴリに分類できます。標識ベースのアプローチでは、タンパク質またはペプチドは、SILAC(細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識)、ICAT(同位体コード化アフィニティータグ)、TMT(タンデム質量タグ)またはiTRAQ(相対および絶対定量のための同位体タグ)などの安定同位体を使用して標識されます。標識ベースのアプローチは、タンパク質をより正確に定量できるという利点を有し、またアイソバリックラベルを用いて、複数のサンプルを1回の実験で分析することができる。ラベルフリーのアプローチは、ラベルベースのアプローチに代わるコスト効率の高い方法です。特定のコホートに属する数百の患者サンプルを分析し、臨床特徴に基づいて他のコホートと比較することができる。ここでは、ライフサイエンス、特にバイオマーカー発見ベースのプロジェクトでの応用に不可欠な、ラベルフリーおよびラベルベースのプロテオームプロファイリング法を用いた組織サンプルの最適化された定量プロテオミクスワークフローについて説明しました。

Introduction

プロテオミクス技術は、疾患1の検出および予後に役立つ候補マーカーの同定と定量を可能にする可能性をする。質量分析の分野における最近の進歩は、タンパク質レベルでの臨床研究を加速しています。研究者たちは、質量分析法ベースのプロテオミクスを用いて、いくつかの疾患の複雑な病態生物学の課題に取り組もうとしており、現在はタンパク質同定と定量化に対する感度の向上を提供しているタンパク質の正確な定量的測定は、健康な個人と病気の個人のタンパク質間の動的および空間的な協調を理解するために重要である3;しかし、このようなプロテオーム規模の分析は容易ではありません。

臨床検体のプロテオミクスプロファイリングの大きな制限の1つは、生物学的サンプルの複雑さである。多くの異なる種類のサンプルが、細胞株、血漿、および組織4、5などのプロテオームの疾患を研究するために調査されてきた。細胞株は、疾患進行の異なる段階を模倣するインビトロ実験のモデルとして広く使用されています。しかしながら、細胞株の1つの大きな制限は、細胞培養6の過程で遺伝子と平解な変化を容易に獲得する点である。プラズマなどの体液は、バイオマーカー発見の魅力的な源となる可能性があります。しかし、タンパク質の豊富さとダイナミックレンジのタンパク質濃度により、血漿プロテオミクスは少し難しい7.ここで、最も豊富なタンパク質から生まれたペプチドは、質量/電荷比が同じ6であっても、低い豊富なタンパク質由来のものを抑制することができる。ここ数年で枯渇と分画技術の進歩がありましたが、良好なカバレッジを得ることは、依然としてプラズマプロテオミクス8、9の大きな限界です。疾患生物学のプロテオーム学的調査のための組織の使用は、組織サンプルが疾患部位に最も近く、疾患生物学10,11に対するより良い洞察を提供するために高い生理学的および病理学的情報を提供するので好ましい。

本稿では、組織試料の定量的プロテオミクスの簡易プロトコルを提供しました。このバッファーは質量分析法に基づく調査と互換性があるため、8 M 尿素を含むバッファーを組織のライセート調製に使用しました。しかし、質量分析計に注入する前に、塩を除去するためにペプチドをきれいにすることが必須です。覚えておかねない重要なポイントの1つは、トリプシンが8M尿素濃度で低い活性を示すため、タンパク質消化のためのトリプシンを添加する前に尿素濃度を1M未満に減らすことです。定量的なグローバルプロテオミクスの2つのアプローチ:iTRAQ(相対および絶対定量のためのアイソバリックタグ)とラベルフリー定量(LFQ)を用いたラベルベースの定量法について説明しました。iTRAQベースの定量プロテオミクスは、主に生物学的状態(例えば、正常と疾患または治療されたサンプル)で変化する複数のサンプルを比較するために使用されます。このアプローチは、ペプチド12のN末端一次アミンを標識する等圧試薬を利用する。iTRAQ試薬は、1つのN-メチルピペラジンレポーターグループ、バランサ基、およびペプチド13のN末端一次アミンと反応する1つのN-ヒドロキシスクッチイミドエステル基を含む。各条件から消化されたペプチドは、特定のiTRAQ試薬で標識される。標識に続いて、反応を停止し、異なる条件からの標識ペプチドを単一のチューブにプールする。この組み合わせサンプル混合物は、同定と定量のために質量分析計によって分析される。MS/MS分析後、低分子質量のレポーターイオン断片が生成され、これらのレポーターイオンのイオン強度がタンパク質の定量化に使用されます。

別のアプローチとして、標識フリー定量法を用いて、安定同位体を有するペプチドを標識することなく、複合体サンプル中のタンパク質の相対数を決定する。

Protocol

この研究は、インド工科大学ボンベイ校(IITB-IEC/2016/026)の機関審査委員会と倫理委員会によって審査され、承認されました。患者/参加者は、この研究に参加するために書面による同意を提供しました。 1. 組織のライセートの準備 注:氷の上で以下の手順をすべて実行して、プロテアーゼを非アクティブに保ちます。メスと使用されるチュー…

Representative Results

私たちは、発見プロテオミクスには、ラベルフリーとラベルベースのプロテオミクスアプローチの2つの異なるアプローチを使用してきました。SDS-PAGE上の組織サンプルのタンパク質プロファイルは、インタクトなタンパク質を示し、プロテオミクス分析のために考慮することができた(図2A)。装置の品質管理チェックは、システム適合性ソフトウェアを介して監視…

Discussion

生物学的サンプルの組織プロテオミクスは、疾患進行の異なる段階に関連する新しい潜在的なバイオマーカーを探求することを可能にする。また、疾患の進行に関連するシグナル伝達および経路のメカニズムについても説明する。組織定量プロテオミクス分析用に記述されたプロトコルは、再現可能な良好なカバレッジデータを提供する。ほとんどの手順は、製造元の指示に従って調整され?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、MHRD-UAYプロジェクト(UCHHATAR AVISHKAR YOJANA)、バイオテクノロジー省(BT/PR13114/INF/22/2015)が支援するIITボンベイのSSおよびMASSFIITB施設へのプロジェクト#34_IITBを認め、MS関連の実験をすべて実施します。

Materials

Reagents
Acetonitrile (MS grade) Fisher Scientific A/0620/21
Bovine Serum Albumin HiMedia TC194-25G
Calcium chloride Fischer Scienific BP510-500
Formic acid (MS grade) Fisher Scientific 147930250
Iodoacetamide Sigma 1149-25G
Isopropanol (MS grade) Fisher Scientific Q13827
Magnesium Chloride Fischer Scienific BP214-500
Methanol (MS grade) Fisher Scientific A456-4
MS grade water Pierce 51140
Phosphate Buffer Saline HiMedia TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail Roche Diagnostics 11873580001
Sodium Chloride Merck DF6D661300
TCEP Sigma 646547
Tris Base Merck 648310
Trypsin (MS grade) Pierce 90058
Bradford Reagent Bio-Rad 5000205
Urea Merck MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column Thermo 25002-102130
Micropipettes Gilson F167380
Stage tips MilliPore ZTC18M008
Zirconia/Silica beads BioSpec products 11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser) Bertin Minilys P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer) Thermo MultiSkan Go
pH meter Eutech CyberScan pH 510
Probe Sonicator Sonics Materials, Inc VCX 130
Shaking Drybath Thermo 88880028
Orbitrap Fusion mass spectrometer Thermo FSN 10452
Nano LC Thermo EASY-nLC1200
Vacuum concentrator Thermo Savant ISS 110
Software
Proteome Discoverer Thrermo Proteome Discoverer 2.2.0.388

参考文献

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  2. Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
  3. Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
  4. Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
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  6. Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
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  9. Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
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記事を引用
Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples. J. Vis. Exp. (177), e61786, doi:10.3791/61786 (2021).

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