生きたバイオバンクの創造と維持 - 私たちはそれを行う方法

近年、がんの形態学的、臨床的、遺伝的特性に関する蓄積された知識が、異種の個々の疾患としての癌の概念につながった。その結果、新生物の変異特性は、臨床的および病理学的特徴に加えて、臨床意思決定の重要性を増し、様々な分子変化のために多くの標的療法が開発された。例えば、大腸癌治療におけるセツキシマブの効力は 、KRASおよびPIK3CA 突然変異状態¹の分析によって予測することができる。精密医療は、各患者で最高の治療応答を提供し、効果の及び治療の毒性を回避するためのカスタマイズされたアプローチを目指しています².バイオバンクは、臨床データにリンクされているがん患者の組織、血液および他の生物学的材料を含み、したがって、翻訳癌研究のための優れたツールです。臨床サンプルの数が多いため、バイオバンクは、個々の患者³に新しい治療機会を提供する稀だが潜在的に薬物性の突然変異の検出を可能にする。

腫瘍学的研究スペクトルを可能な限り広くカバーするために、我々はサンプル採取だけに関する活動を抑制するのではなく、患者由来の癌細胞株および異種移植片(PDX)の確立に焦点を当てた。従来の2D細胞株は、インビトロ研究の礎石であり、大規模な薬物スクリーニングのための主要な選択肢^{である4、5。}さらに、細胞株分析は、多くの場合、より簡単で安価で、より容易に入手できます。さらに、患者由来末梢血リンパ球(PBL)が利用可能であるため、腫瘍免疫学もvitro6で研究することができる。しかしながら、インビトロまたはインビボ実験に基づく細胞ベースで有望な前臨床効果を有する新開発薬の大半は、臨床試験⁷で失望的な結果を示している。対照的に、インビボ研究におけるPDXに基づく前臨床試験は、抗腫瘍剤の臨床活性をより忠実に^{反映している8.}PDX組織はドナー腫瘍の組織学的および分子的性質を密接に反映しているため、PDXモデルは、バイオバンクの完全性を維持し、研究グループと機関間のサンプル交換を可能にするために、しばしば非常に限られた量の生存可能な腫瘍組織を伝播させる良い方法である。また、PDX組織に由来するがん細胞株は、原発癌細胞株⁹よりも有意に容易に確立できる。近年、当研究室では、問題の全生物試料のワークフローを段階的に標準化・最適化することにより、総合的な大腸がん・膵臓がんバイオバンクを総合的に構築しています(図1)。

図1: バイオバンクのワークフローと組織 は、こちらをクリックして、この図の大きなバージョンを表示してください。

以下の研究は、大学医療センターロストックの機関審査委員会によって承認されています (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 とA 2019-0222).さらに、すべての獣医関連の手順は、登録番号LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17および7221.3-1-00/19/19/19/19/19登録番号の下でランデサムト・フュル・ランドヴィルトシャフト、レーベンスミッテルシヒャーハイト・ウント・フィスチェレイ・メクレンブルク=フォアポンメルンによって承認されています。

1. 実験の前提条件

1. バイオバンクを確立し、維持するために、いくつかの重要な枠組条件を満たす。
   1. 手術部門と十分な数のオンコロジー切開術を備えた診療所を、設備の整ったラボと十分な教員と一緒に使用してください。優れたインフラと協力病理部門との強固な連絡は、さらなる前提条件です。
   2. インビボ研究では、免疫不全マウスに適した住宅条件を有する動物施設を使用する。
   3. 医療倫理委員会から患者由来の資料に関する研究の承認を得る。現地の法規制に従って、権限のある機関から インビボ 研究の承認を得る。

2. サンプルコレクション

1. 手術前日
   1. バイオバンキングの適格性について、切除性大腸癌または膵臓癌および/または対応する転移を有するすべての患者を評価する。ネオアジュバント前処理、非常に小さな腫瘍、不確実な尊厳の腫瘍、または以前に部分的に切除された病変の症例を含めないようにしてください。
   2. 外科的処置に関するインフォームド・コンセントの議論の間に患者からの参加の書面による承認を得る。すべての関与した外科医、実験室チーム、病理学者にタイムリーに知らせます。
2. サンプル取得
   1. 手術室(OR)のすべてのアテンダントに、手術の開始直前にバイオバンクの組織コレクションについて知らせます。
      注:組織をホルマリンで固定しないことが重要です。組織がホルマリンに沈んでいる場合、統合バイオバンキングには適さない。
   2. 40 mLのヘパリン化血液(2 x 20 mLシリンジ)と麻酔誘導直後の標準的な7.5 mL血清管を引き出し、PBL分離および血清処理のためにラボに素早く移します(ステップ3-4を参照)。
   3. 手術台から直接切除標本を入手し、適切な容器に入れ、病理学部門に持って行く。循環、切除および病理への到着からの剥離の時点を書き留める。
      注:バイオバンキングのための標本の適合性は、腫瘍および非悪性組織のスライスを解剖する協力病理学者によって評価されるべきです。その後の病理報告を損なう可能性のある標本の一部を自分で物品切りしないでください。
   4. 両方の組織片を10〜30 mLの組織貯蔵溶液(またはDPBS)を氷の上に付けた別個の15〜50 mLポリプロピレンチューブに入れる。領収書の時刻を書き留め、すぐに検査室に移します。
      注: 次のプロトコルステップ 3- 6 は、厳密な滅菌条件下で層流キャビネットで行う必要があります。すべての液体を室温で使用してください。

3. 血清処理

1. 7.5 mLの血清管を1128 x gで遠心し、4°Cで予め冷却された遠心分離機で15分間遠心分離します。
2. アリコート1 mLの血清は、あらかじめ標識されたクライオチューブ中のチューブあたり、液体窒素で凍結する。

4. 密度勾配遠心分離によるPBLの分離

注:20 mLのシリンジのそれぞれと平行に動作します。

1. 20 mLのヘパリン化された血液を50 mLのポリプロピレンチューブに充填し、15 mLのDPBSを加えます。
2. 血清学的ピペットでパンコルの15 mLを取り、ポリプロピレンチューブの底まで慎重にピペットを挿入し、血液/DBPS列の下に層を形成するためにパンコルを非常にゆっくりと解放します。
3. ブレーキ なしで 15分間375 x gで遠心分離機。
4. 吸引し、両方のサンプルの中間と上段の間の不透明な相間層を新鮮な50 mLポリプロピレンチューブに移し、DPBSで50 mLに充填します。
5. ブレーキ付き15分間270 x g で 遠心分離機。
6. 上清を吸引し、廃棄し、細胞ペレットを4.5mLの冷凍培地に再懸濁する。
7. アリコート1.5mLのサスペンションは、1クライオチューブあたり、チューブをしっかりと閉じ、ゆっくりと凍結するのに適した凍結容器に入れ、-80°Cで保管します。

5. 組織処理

注:核酸の完全性を維持するために、腫瘍と健康な組織のスナップ凍結サンプルの生成から始めます。

1. 腫瘍組織標本
   1. ポリプロピレンチューブからペトリ皿に組織貯蔵液の数mLで腫瘍標本を移す。必要に応じて DPBS でリンスします。標本に触れないようにし、組織を処理するために2つの無菌メスを使用してください。いつでも乾燥を避けてください。
   2. 別の皿の便利なスケールで腫瘍標本を量り、ティッシュの重量に注意してください。
   3. 切断前に腫瘍組織のサイズ、形状および組織の質を評価する。スナップ凍結のためのピンヘッドの大きさの少なくとも1枚と、重要な凍結保存のためにそれぞれ約30mm³⁽ エッジ長3 x 3x 3mm)の4つの立方体を得ることを目指してください。可能な限り4倍に30mm^3- 立方体を生成し、5つの4倍あたりスナップ凍結のための1つのピースを生成します。また、キューブが重要な組織のみで構成されるように壊死部分を切断する必要があることを考慮に入れます。
   4. 厚さ3mmのスライスを生成します。壊死部分を切り取り、ゲル状または液体塊と区別し、スライスを2つの所望のサイズの立方体に切り取ります。
      注: この時点では、組織を廃棄しないでください。
   5. スナップフリーズ
      1. それに応じてクライオチューブにラベルを付けます(ステップ7.7を参照)。
      2. あらかじめラベル付けされたクライオチューブごとに小さな組織片を1つ置きます。サンプルを液体窒素に数分間直ちに沈め、その後-80°Cで保管します。
   6. 重要組織の凍結保存
      1. クライオチューブに応じてラベルを付け(ステップ7.7を参照)、それぞれ1.5mLの冷凍培地を充填します。ベンチの横に冷凍容器を置きます。
         注: できるだけ早く次の手順に従ってください。冷凍媒体中のDMSOは細胞傷害性を有するので、組織が適切な冷却なしに冷凍媒体に沈下される時間は2分を超えないようにすべきである。
      2. 30 mm³ キューブを 4 倍に並べ替えます。壊死組織などを皿の端に残しますが、捨てないでください。
      3. メスの刃で立方体をすくい、クライオチューブあたり4キューブを転送します。腫瘍片が完全に冷凍庫媒体に沈めていることを確認してください。チューブをしっかりと閉じ、ゆっくりと冷凍するのに適した凍結容器に入れ、-80°Cの冷凍庫に保管します。
      4. -140°C以下で長期保存のために適したストレージシステムにクライオチューブを移す。検査室在庫管理システムの文書化は必須です。
2. 健康な組織標本:ステップ5.1.1を繰り返す。健康な組織標本のために5.1.6.4に。

6. 初等細胞培養

1. 壊死性のスクラップを含む腫瘍組織の遺跡をペトリ皿に含むメスをできるだけ小さく分解する。
2. 50 mL ポリプロピレンチューブの上に滅菌セルストレーナー(100 μmの細孔サイズ)を置きます。
3. セロカルピペットを使用して、ペトリ皿に5〜10 mLのDPBSを加え、残りの組織を浮かべ、ピペットを上下に浮かべ、懸濁液を生成します。
4. ピペットを含む懸濁液を細胞ストレーナーに移します。
5. すべての組織がペトリ皿から解決されるまで、ステップ6.3-6.4を繰り返します。
6. 20 mLの一方向シリンジのプランジャーを使用して、細胞ストレーナーを通して細胞と組織の懸濁液を絞ります。
7. 新鮮なDPBSの5〜10 mLでリンスし、細胞のストレーナーを捨てて、チューブを適切に閉じます。
8. 懸濁液を180xgで5~10分間遠心分離する。
9. コラーゲンIプレコーティング6ウェルプレートを1.5mLの培地で準備します。
10. 吸引し、上清を捨てる。ペレットをDPBSまたは培地の3 mLに再び懸濁し、各ウェルに500 μLの懸濁液を加えます。プレートをインキュベーター(湿度100%、CO2 5%、37°C)に入れる
11. 細胞の成長と汚染についてプレートを毎日監視します。
    注: 永久的な細胞株の確立のポイントまでのさらなる細胞培養は、ここでは説明しません。

7. PDX 生成

1. in vivo 実験は、管轄の権限の要件を満たす適切な資格を持つ者によってのみ行ってください。
2. 使用されたマウス株の要求を満たす特異的病原体フリー(SPF)条件下で免疫不全マウスを収容する。衛生的な対策には、個別に換気されたケージ、オートクレーブ食品、水、ネスティング材料、安全エアロック、個人用の保護具の着用が含まれます。
3. すべての器具を事前にオートクレーブし、クロスコンタミネーションを避けるために各腫瘍ケースに1セットの器具のみを使用します。腫瘍組織をできるだけ無菌として扱う。以下に記載されているすべてのプラスチック製品は、無菌、単独使用および各手術後に廃棄する必要があります。
   注:クリオチューブあたり4つの腫瘍組織片を凍結する方法によって決定され、PDX生成は、サンプルあたり常に2匹のマウスを必要とし、理想的には4つのPDX腫瘍をもたらす。
4. 実験室在庫管理システムを介して生着するための所望の原発腫瘍を選択し、主貯蔵タンクからポータブル液体窒素容器にサンプル(極めて保存された腫瘍組織)を移す(ドライアイス上の-80°Cの中間貯蔵も便利である)。
5. SPFセクション(スクラブ、下駄、エプロン、ヘアカバー、外科用マスク、オーバーシュー)に入る前に個人用保護具を着用し、手とすべての機器を消毒してください。
6. マトリゲル浸漬
   1. 液体窒素容器を形成するクライオチューブを取り除き、試料の解凍を待ちます。
   2. 50 mL ポリプロピレンチューブにラベルを付け、35 mL の DPBS を充填します。
   3. クライオチューブを上下に傾け、組織中スラッシュがシフト可能になるとすぐにポリプロピレンチューブに内容を移します。腫瘍組織片をそっとすすいで、チューブから主な容積を別の容器に捨て、蓋を閉めてチューブを上下に下げ、4つの組織片が蓋に集まるようにします。
   4. 冷却アキュムレータにペトリ皿を置き、マトリゲルの100 μLを1滴の真ん中に置きます。解剖鉗子を使用して、腫瘍片をマトリゲルに移す。各作品がマトリゲルで完全に覆われていることを確認してください。4°Cで10分間インキュベートする。
7. マウス麻酔(1サンプルあたり2匹のマウス、並行して働く)
   1. ケタミン(100mg/mL)とキシラジン(20mg/mL)麻酔液の3:1ストックを調製します。推奨用量は90/6 mg/kg体重です。
   2. マウスの重量を量り、必要な麻酔液を単一の使用インスリン注射器に引き出す。
   3. ケージのグリッドにマウスを置き、片手で尾を優しく引っ張って前方移動を誘発し、同時に他方の手のピンチグリップで首をカニ。グリッドのマウスを持ち上げて持ち手を回し、動物の背中が手のひらの上に置かるようにします。後ろ足の1つをピンキーで固定し、腹腔内に麻薬を注入します。マウスをケージに戻し、麻薬誘導を待ちます。
   4. 麻酔したマウスを加熱プレートに置き、角膜の害を避けるために軟膏で目を覆います。手術用鉗子でマウスの後ろ足を優しくつまんで麻酔の深さを突き上げます。
      注意:動きの欠如は深いナルコシスを示します。あらゆる種類の動きは、望ましい麻薬深度に到達するためのより多くの時間または麻酔薬の追加用量を必要とします。
8. 手術
   1. マウスの首をつまんで皮膚の折り目を形成し、マイクロチップをアプリケータで皮下に注入する(プログラミングの詳細についてはステップ9を参照)
   2. 必要に応じてマウスの側面を剃り(NMRI^nu/nu マウスはシェービングを必要としない)、綿棒でポビドネヨウ素を塗布し、外科用ドレープを使用して生殖不能場を作ります。
   3. 外科用鉗子で側面の皮膚を持ち上げ、4mmの小さな切開を行い、はさみで鈍い準備をして小さな皮下ポケットを形成する。
   4. 各ポケットに1つの腫瘍片を入れ、後端に置きます。
   5. 100 μL ピペットチップの端をクリップし、ペトリ皿から残りのマトリゲルを吸引し、各スキンポケットに均等に塗布します。
   6. 簡単な中断縫合糸で傷を閉じ、スプレードレッシングを適用します。
9. マイクロチップをスキャンし、マウスおよび腫瘍IDの有効性を確認します。
10. 新鮮な寝具とネスティング素材、かじりスティックで新しいケージを準備します。ペーパータオルから「クッション」を折り、赤外線ヒートランプの下に高い頭でマウスを置きます。
11. 0.25 mLのトリメトプリム/スルファメトキサゾール(400mg/80 mg)を100mLの飲料水と混ぜ、飲用ボトルを介して投与します。1つのマウスが毎日体重1kgあたり約150 mLを消費することを考えてください。
    注:皮下PDXモデルは術後疼痛と関連しないため、創傷治癒過程中でも腫瘍の成長中にも、術後鎮痛は必要ありません。あなたの機関/権限の動物福祉ガイドラインは異なる場合がありますのでご注意ください。
12. 実験動物のモニタリング
    1. 苦痛の徴候を毎日マウスを監視する。これは、資格のある動物の世話人に委任することができます。
    2. 前述の投与量で術後抗生物質治療を4週間続ける。抗生物質の混合物を週に2回交換してください。
    3. 少なくとも週に1回、理想的には毎日、キャリパー(腫瘍容積= 0.52 x 長さx幅x高さ[mm^3]))を使用して腫瘍のサイズを測定し、データベースに記録します。

8. PDXの収穫および処理

1. 収穫し、PDX腫瘍を処理します, 場合:
   腫瘍サイズは目標体積1.500mm3に達する。
   腫瘍を持つ動物は苦痛および/または病気の徴候を示し、治療は無駄である。
   腫瘍は潰瘍化したり、マウスの皮膚に浸透したりする。
2. マイクロチップを読み取って、正しいPDXを特定します。
3. 例えば_CO2-窒息またはケタミン/キシラジン注射に続いて頸部脱臼が続くとして、法的方法(国のガイドラインに応じて)によってマウスを安楽死させる。
4. 側面で外科的鉗子で皮膚を持ち上げ、腫瘍から数ミリメートル離れたメッツェンバウムのはさみで切開します。
5. 鈍い準備によって腫瘍の上の皮膚を切り離し、次に解剖学的鉗子で腫瘍を慎重に把握し、身体の表面的な筋膜から腫瘍を取り外す。
6. DPBSで腫瘍を洗い、ペトリ皿に入れ、隣接する結合組織を取り除きます。
7. この時点で、次のいずれかを実行します。
   1. 30 mm³ キューブをカットし、新しい PDX を作成します (ポイント 7.7.4 でプロトコルを続行します)。
   2. 腫瘍をスライスに切り、組織学的カセットに移し、後のパラフィン埋め込みのために4%ホルムアルデヒドに保存する。
   3. 組織貯蔵溶液を含むチューブ内の腫瘍を保存してバイオバンクに追加(ステップ3でプロトコルを進める)、PDX由来の細胞株を作成する(ステップ4でプロトコルを進める)。

バイオバンクとデータ管理

1. 表 1に従って、各腫瘍ケースに内部 ID を割り当てます。

表 1: サンプル ID の定義。

2. 患者の同意を腫瘍IDと共に電子および紙の形態で保管する。
3. できるだけ多くの臨床データを収集し、匿名化し、別々に保存します。
4. データ管理ソフトウェア(例えば、フリーザーワークス)または他を使用して、耐熱性、自己固執バーコードラベルを生成するためにラベル印刷ソフトウェアとのインタフェースを作成します。
5. データ管理ソフトウェアを開いて新しいサンプルを追加し、検体の種類を定義し、次の情報を記録します:腫瘍ID、組織タイプ、凍結方法、日付、責任ある従業員、通過番号、マウスIDおよびマウス株。
6. サンプルを保管タンク内の特定の位置に割り当てます。
7. PDX のトレースとモニター (手順 7-8 に適用)
   1. MS Access データベース (または同様のシステム) をポータブルでBluetooth対応デバイス (ラップトップまたはタブレット) で使用して、腫瘍 ID、移植日、安楽死日、マウスの年齢およびひずみ、および時間の経過に応じて腫瘍の成長を記録します。
   2. マイクロチップリーダーをデバイスに接続し、マイクロチップを移植前に読み取ります。
   3. 各マウスに特定の ID を割り当てます。次のスキームを使用します: (下記の表 2 を参照)
   4. 移植後、データソース内のマウス特性とともにIDを記録します。
   5. マイクロチップを再読み込みして、マイクロチップの仕様、データ・ベース、クライオチューブのラベルが一貫しているかどうかを確認します。
   6. それに応じて、各マウスケージのラベルを作成します。
      メモ:物理的なバックアップを作成するには、対応するマイクロチップラベルを含むcryoTubeラベルを小冊子に貼り付け、日付とマウスの歪みをメモします。
   7. 個々のPDXの腫瘍増殖をモニターするには、データベース装置に接続されたリーダーでマウスのマイクロチップをスキャンして識別し、毎週キャリパーで測定された腫瘍サイズを記録する。
   8. 腫瘍の成長曲線を解析してPDX収穫の理想的な時点を計画する。

表 2: PDX ID の定義

我々の手では、一次細胞培養の確立率(図2A及びB)は、大きなシリーズ9&D

何一つ。