方法論記事

スレッド塞栓法による上矢状・中症のラットモデルの確立

DOI：

10.3791/62118

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2021年7月4日

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1Department of Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital and Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, 2Rehabilitation Department, Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 3Department of Neurosurgery, the Hospital of Changle, 4Pediatrics Ward 2, Shouguang Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 6National-Local Joint Engineering Research Center of Rehabilitation Medicine Technology, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 7Rehabilitation Industry Institute, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 8Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、糸塞栓法により優れた矢状静脈ス(SSS)血栓症の新しいスプレイグ・ドーリー(SD)ラットモデルを確立し、その安定性と信頼性を検証した。

要約

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脳静脈静脈血栓症(CVST)の自然発症に寄与するメカニズムはほとんど知られておらず、様々な制御不能な要因が疾患の経過に関与しており、臨床研究において大きな限界をもたらす。従って、制御不能な様々な交絡因子を標準化できる安定したCVST動物モデルの確立は、臨床研究における欠点を回避するのに役立った。ここ数十年、様々なCVST動物モデルが構築されていますが、これらのモデルに基づく結果は矛盾しており、不完全でした。したがって、CVSTの病態生理学的メカニズムをさらに探求するためには、CVSTの診断と治療に重要な実用的価値と科学的意義を有する新しく、高い適合性の動物モデルを確立することが必要である。本研究では、スレッド塞栓法により、優れた矢状静脈炎(SSS)の新しいスプレイグ・ドーリー(SD)ラットモデルを確立し、モデルの安定性と信頼性を検証した。さらに、CVSTの形成後のラットにおける脳静脈血流の変化を評価した。総称して、SDラットSSS-血栓症モデルは、容易に確立され、外傷を最小にし、良好な安定性を生じさせ、虚血的なタイミングおよび位置を正確に制御することを可能にする新しいCVST動物モデルを表す。

概要

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脳静脈静脈血栓症(CVST)は、脳卒中の全原因のわずか0.5〜1.0%を占めるが、小児および若年成人において比較的高い発生率を有する脳静脈系の稀な疾患である。解剖の間に、CVSTは脳血管疾患死亡の10%の原因であることが判明した2.血栓症は頭蓋内静脈系の任意の部分で起こり得る。上矢状のSSSはCVSTの最も一般的に影響される区域の1つであり、複数の血管を含むことができる。静脈洞の狭窄または閉塞のために、頭蓋内静脈戻りが遮断され、頭蓋内圧が上昇する場合が多い3。CVSTの臨床症状は複雑であり、時間の経過とともに変化する。症状の特異性の欠如があるが、最も一般的な症状は、頭痛(77.2%)、発作(42.7%)、および神経学的欠損(39.9%)を含む。重症例では、昏睡状態、さらには死亡が4、5に起こる。近年、医療・健康水準の全体的な改善と公衆衛生意識の向上により、関連する危険因子の割合が変化し、外傷や感染の割合が減少し、妊娠、プエルペリウム、経口避妊薬等によるCVSTの割合が徐々に増加している。

現在のところ、CVSTの病因はまだ十分に理解されていない。CVSTを深く探索するには、さらなる病態生理学的研究が必要である。しかし、これらの研究方法のほとんどは侵襲的であり、したがって臨床的に実施することは困難である。臨床研究の多くの制限により、動物モデルは基礎研究と翻訳研究の面でかけがえのない利点を有する。

CVSTの原因は複雑であり、初期発症はしばしば認識されず、血栓形成の位置は非常に可変である。幸いなことに、動物モデルはこれらの要因のより良い制御を達成することができます。過去数十年の間に、CVST動物モデルの様々な確立され、各モデルは、独自の欠点を持っています。異なる生産方法に従って、それらは大まかに次のカテゴリに分けることができます: 単純なSSS-ライゲーションモデル6,7;SSS 内部インジェクション アクセラレータ モデル8;塩化第二鉄誘発性SSS血栓症モデル9;光化学的に誘導されたSSS血栓症モデル10;自作の塞栓症-閉塞SSモデル11.しかし、これらのモデルのほとんどは、動物の大脳皮質への侵襲的損傷を回避することができず、虚血的な時間と位置を正確に制御することができません。一部のモデルでは、血栓は自発的に再キャロナイズします。他のモデルでは、SSSは永久に閉塞します。さらに、複雑な手術や重傷は、これらのモデルのその後の病態生理学的所見に影響を与える可能性があります。

本研究では、スプレイグ・ドーリー(SD)ラットのSSSに糸プラグを挿入し、損傷を最小限に抑え、正確な制御性を可能にし、良好な安定性をもたらすCVSTモデルを確立することに成功した。さらに、小型動物磁気共鳴画像(MRI)とレーザースペックル血流イメージングを組み合わせて、モデルの有効性を検証しました。モデルの確立前後の脳血流の変化を評価し、モデルの安定性を評価し、CVSTの発生、発達、関連病態生理学的メカニズムを探求するさらなる研究の基礎を築いた。

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プロトコル

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動物の被験者に関する手続きは、温州医科大学の医療規範倫理委員会によって承認されており、実験動物の使用とケアに関する中国の法律に従っています。

1. スレッドプラグ、SDラット、実験装置の準備

  1. ねじプラグ本体には直径0.28mmのナイロン糸を使用してください。
    注:ナイロン糸の柔らかさと硬さは適度でなければなりません。
  2. ナイロン糸の一端をシリコン材料で覆います。糸プラグのシリコン部分の長さは約1.2cm、直径は約1.2mmです。ヘッドエンドは先細りで、シリコーン部分は円筒形です。さらに5〜7cmを予約してください。ナイロン糸はクランプが容易で、操作後の特定の必要性に従って切断することができる。
  3. 75% エタノールを使用して、操作の前にスレッドプラグを3分間浸し、差し込む前に通常の生理食糸で残留エタノールをすすきます。
  4. 体重280~320gの雄SDラットを12匹選択し、ランダムにシャム群と実験群(n=6群)に分ける。環境適応の1週間後、ラットを12時間速くし、操作の前に4時間水を奪う。
  5. 実験に必要な実験装置を準備します:小動物麻酔装置、脳立体立体測定器、解剖顕微鏡、高速頭蓋骨ドリル、はさみ、ピンセット、血管鉗子、針ホルダー、針糸、2 mLシリンジ、レーザースペックル血流イメージングシステム、および小動物MRIスキャナー。

2. スレッド塞栓によるSDラットSSS-塞栓モデルの構築

  1. SDラットを麻酔誘導ボックスに入れ、小動物麻酔機を使用して4%のイオブルランを送達して麻酔を誘発します。その後、鉗子を使用して、SDラットの後肢と足の指が適度なつまみに反応しないことを確認する。
  2. 脳立体立体装置の傾向のある位置に剃った上の髪を持つSDラットを素早く修正します。1.5~2.0%のイオブルラン(速度0.5 L/分)で麻酔を維持し、呼吸速度を40~60呼吸/分で安定させます。37±0.2 °Cの加熱パッドでラットの体温を安定させます。
    1. ラットを立体性フレームに置いた後に無菌眼用潤滑剤を塗布し、麻酔中の乾燥から角膜を保護します。
  3. ラットの頭部の表面を、75%エタノールで3回交互に5%ポビドンヨウ素で殺菌します。頭の真ん中に皮膚切開(長さ2.0cm)を作り、上筋膜と骨膜を慎重に剥がして頭蓋骨を完全に露出させます。
    1. 前セルタネル、後部フォンタネル、冠状縫合、矢状縫合、およびヘリンボーン縫合糸の位置を確認します。
  4. コロナ縫合糸とヘリンボーン縫合糸の間の領域を血流観察領域として使用します。レーザースペックル血流イメージング中の観察に影響を与えるから頭蓋骨を防ぐために、血管がはっきりと見えるまで観察領域の頭蓋骨を薄くする。薄くなった頭蓋骨のサイズは約1.0cm×1.0 cmである必要があります。このステップおよび以下は、すべて解剖顕微鏡下で行われる。
    1. 頭蓋骨研削中は、常温生理食い物を使用してドリルを繰り返しすすいで、大脳皮質への高温熱を避けます。
  5. ブレグマを中心とした6.0 mm x 4.0 mmの骨窓内で頭蓋骨を粉砕し、ブレグマ領域のSSSを露出させるために高速ドリルを使用してください。
    1. 粉砕中に頭蓋骨を冷却するために通常の生理食い物を使用してください。頭蓋骨が薄くなったら、ピンセットを使用して残りの骨片を慎重に取り除き、SSSを引き裂かないようにします。
  6. 適切なスレッドプラグを選択し、プラグポイントとしてSSSブレグマポイントを使用し、慎重に2 mLの注射針でそれを穿刺し、すぐにプラグポイントにスレッドプラグヘッドを挿入します。
    1. この時点で、スレッドプラグヘッドの端とSSSの間の角度は約30〜45°である必要があります。その後、ねじプラグの端とSSSの間の角度を0〜10度に調整し、ヘッドが角線合流の後縁に達するまでゆっくりとSSSを中央に挿入します。その後、尾の余分な部分を切り落とす。
      注:SSSが穿刺されると、急速な出血が発生する場合があります。ねじプラグの端を一度にプラグポイントに素早く挿入できない場合は、小さいガーゼまたはコットンボールを使用して、プラグポイントをゆっくり押しながらゆっくりと滑り下ろしてプラグポイントを慎重に露出させ、ワイヤーボルトの端をSSSに素早く挿入します。糸栓が挿入された後、プラグポイントで出血がある場合、ゼラチンスポンジなどの止血材料を使用して出血を止めることができる。

3. SDラットの脳表面における血流の検出

  1. レーザー光源を使用して、血流観測領域を均一に照らします。反射光はカメラによって収集され、分析のためにコンピュータに送信されます。レーザースペックル血流イメージングシステムでは、次のパラメータ設定を使用します: 波長: λ = 785 nm;および画像の露出時間: T = 10 ミリ秒。
  2. SDラットの血流観察領域をレーザースペックル血流イメージングシステムの視野に中央に配置し、脳表面の血流を2分間連続的にモニタリングします。各SDラットの塞栓処理前後の血流データを収集処理し、観察領域のレーザースペックル血流マップを取得する。
  3. 操作した領域を通常の生理食前で繰り返し洗い流し、骨の破片や残渣を洗い流します。皮膚を縫合し(0#糸)、ヨウ素で消毒する。
  4. ラットが手術後に目覚めるまで体温を維持し、その後、食べ物と水が提供された単一のケージに収容 します。シャムグループを接続することはできません。
  5. データ収集が完了したら、後処理を実行します。
    1. レーザースペックル血流イメージングシステムソフトウェアによって提供されるツールを介して関心領域(ROI)の完全な選択。得られた値はROIの平均血流値であり、塞栓術前後の局所的な脳血流値である。塞栓前の血流値をベースライン値として使用します。
    2. 4つのROIを選択し、ベースライン値からの変化率として表される各ROIにおける脳血流の相対的変化を測定する。

4. 小動物MRI上の糸位置の検出

  1. MRIイメージングシステムに対して次のT2重み付けイメージング(T2WI)パラメータを使用:エコーの時間(TE)= 33 ms、 繰り返し時間(TR)=3000ミリ秒、励起数(NEX)=4、スライス=28、スライス厚=0.8mm、マトリックスサイズ=256*256mm2、反転角=80°、視野(FOV)=30*30mm2、スキャン時間= 6分24秒;磁気共鳴血管造影(MRA)パラメータは、TE = 4.4 ms、TR = 12 ms、NEX = 4、スライス= 80、スライス厚= 0.4mm、マトリックスサイズ= 256*256 mm2、フリップ角度= 80°、FOV = 30*30mm2、スキャン時間= 16分23秒40msに設定しました。
  2. MRIスキャンテーブル上で動物を固定し、スキャンを位置決めして脳位置を較正し、位置を確認した後にT2WIおよびMRAシーケンススキャンを行う。
  3. 検出中に動物麻酔機を介して連続麻酔を使用してください。次いで、過剰なペントバルビタールの腹腔内注射によりSDラットを安楽死させる。
  4. 画像取得および後処理:画像データを収集した後、SSSにおける糸プラグの状態をより明確に観察するために、擬似色調増強法を用いてラット脳のT2WI画像を表示する。

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結果

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縫合法を介してSDラットSSS-血栓症モデルを確立するためには、縫合を事前に用意し(図1A)、実験に必要な装置(図1B)を用意する必要があります。操作の繊細な性質のために、モデルの準備は解剖顕微鏡の下で完了する必要があります。主な手順を図2に示します。モデルの血流観察の具体的な詳細の説明を容易にするために、図3Bは血流観察領域、骨窓、およびプラグポイントをマークし、また、SSSに挿入された糸栓の状態を示す(図3C)。モデルの調製が完了した後、SDラットの脳表面の血流を検出するためにレーザースペックル血流イメージングが使用される(図4A、B)。図4Cは、SSSおよびブリッジ静脈(BV)における...

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ディスカッション

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本研究では、自作のスレッドプラグをSDラットのSSSに挿入することで、新しいタイプのCVSTモデルが確立されました。さらに、レーザースペックル血流イメージングと小動物MRIを組み合わせて、虚血的なタイミングと位置を標準化するために、塞栓前後のSDラットの脳表面の血流の変化を監視した。

1989年、ロンガらはラット12の外頸動脈に自作ナイロン縫合糸を逆行して逆方向MCA咬合モデルを作った。このモデルの安定性を向上させるために、いくつかの改良された方法が導入されて13.このMCAオクルージョンモデルは、正確な虚血タイミングおよび位置を可能にし、再カナリ化が容易であり、そして大脳動脈脳卒中14、15を調査する基礎研究で広く使用されている。本研究では、MCAOモデルの設計に基づいて、自作の糸プラグをSSS開始位置の中心に挿入して新しいCVSTモデルを確立した。

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開示事項

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著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

謝辞

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本研究は、福建省伝統医科大学(X2019002)の高レベル人材科学研究財団の助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2 mLシリンジベクトン、ディキンソン アンド カンパニー301940
脳定位固定装置深セン RWD ライフ テクノロジー株式会社68025
解剖顕微鏡武漢 SIM オプトテクノロジーSIM BFI-HR PRO
高速頭蓋骨ドリルShenzhen RWD Life Technology Co., Ltd78046
レーザースペックル血流イメージングシステムWuhan SIM Opto-technology Co.SIM BFI-HR PRO
ニードルホルダー深セン RWD Life Technology Co., LtdF31022-12
針糸Shenzhen RWD Life Technology Co., LtdF33303-08
はさみShenzhen RWD Life Technology Co., LtdS13029-14
シリカゲルヘレウス・クルツァー302785
小動物麻酔器深センRWDライフテクノロジー株式会社R540
小動物MRIBruker Medical GmbHBiospec 94/30 USR
ピンセット深センRWDライフテクノロジー株式会社F11029-11
血管鉗子深センRWDライフテクノロジー株式会社F22003-09

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bousser, M. G., Ferro, J. M. Cerebral venous thrombosis: an update. Lancet Neurology. 6 (2), 162-170 (2007).
  2. Guenther, G., Arauz, A. Cerebral venous thrombosis: A diagnostic and treatment update. Neurologia. 26 (8), 488-498 (2011).
  3. Stam, J. Thrombosis of the cerebral veins and sinuses. New England Journal of Medicine. 352 (17), 1791-1798 (2005).
  4. Einhäupl, K., et al. EFNS guideline on the treatment of cerebral venous and sinus thrombosis in adult patients. European Journal of Neurology. 17 (10), 1229-1235 (2010).
  5. Coutinho, J. M., Zuurbier, S. M., Stam, J. Declining mortality in cerebral venous thrombosis: a systematic review. Stroke. 45 (5), 1338-1341 (2014).
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  9. Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
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  11. Yang, H., Meng, Z., Zhang, C., Zhang, P., Wang, Q. Establishing a new rat model of central venous sinus thrombosis and analyzing its pathophysiological and apoptotic changes. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 130-135 (2012).
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  13. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  14. Wang, E., et al. Mapping tissue pH in an experimental model of acute stroke - Determination of graded regional tissue pH changes with non-invasive quantitative amide proton transfer MRI. Neuroimage. 191, (2019).
  15. Liu, C., et al. Identification of Vigilin as a Potential Ischemia Biomarker by Brain Slice-Based Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment. Analytical Chemistry. 91 (10), 6675-6681 (2019).

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Sprague DawleyMRI

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