概要

等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

Published: August 12, 2021
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概要

この分画プロトコルにより、研究者は哺乳類細胞から細胞質、核、ミトコンドリア、および膜タンパク質を単離することができます。後者の2つの細胞内画分は、等密度密度勾配を介してさらに精製される。

Abstract

このプロトコルは、界面活性剤、機械的溶解、および等密度勾配遠心分離の組み合わせを使用して哺乳類細胞から細胞内タンパク質画分を得る方法を記載しています。この手順の主な利点は、細胞内画分を得るために可溶化洗剤の単独使用に依存しないことです。これにより、原形質膜を細胞の他の膜結合オルガネラから分離することができる。この手順は、再現性があり、スケーラブルで、選択的な方法で細胞内のタンパク質局在の決定を容易にします。この方法は、ヒト単球細胞株U937から細胞質、核、ミトコンドリア、および原形質膜タンパク質を単離するために首尾よく使用されています。この手順は、この細胞株用に最適化されているが、他の細胞株の細胞内分画の適切な出発点として役立ち得る。手順の潜在的な落とし穴とそれらを回避する方法、および他の細胞株について考慮する必要があるかもしれない変更について説明します。

Introduction

細胞内分画は、細胞を溶解し、いくつかの方法でそれらの構成成分に分離する手順です。この技術は、哺乳類細胞におけるタンパク質局在を決定したり、他の方法では検出できない低存在量のタンパク質の濃縮に研究者が使用できます。細胞内分画の方法は現在存在しますが、購入可能な市販のキットと同様に、この手順で克服しようとするいくつかの制限があります。ほとんどの細胞分画法はもっぱら界面活性剤ベースであり1,2、さまざまな細胞成分を可溶化するために、ますます多くの界面活性剤を含むバッファーの使用に依存しています。この方法は迅速で便利ですが、不純な分数になります。これらは、研究者が細胞の1つまたは2つの成分を簡単に分離できるように設計されていますが、サンプルから複数の細胞内画分を同時に分離するほど複雑ではありません。界面活性剤のみに依存すると、通常、膜に囲まれた細胞小器官と原形質膜が無差別に可溶化され、これらの成分の分離が困難になります。これらのキットの使用による追加の複雑さは、ほとんどのコンポーネントが独自の製剤であるため、研究者が特定のアプリケーション向けにそれらを変更/最適化できないことです。最後に、これらのキットは法外に高価になる可能性があり、使用回数に制限があるため、より大きなサンプルには理想的ではありません。

界面活性剤に依存しないミトコンドリアの単離のためのキットが利用可能であるにもかかわらず、それらは原形質膜を単離するようには設計されておらず、標準的な単離プロトコルよりも有意に少ない量のサンプルを生成する3,4。差動遠心分離法はより時間がかかりますが、多くの場合、洗剤ベースのキットだけでは得られない明確な画分が得られます1。可溶化界面活性剤を単独で使用せずに分離することで、超遠心分離と等密度密度勾配を使用したさらなる精製も可能になり、交差汚染が少なくなります。この分画プロトコルは、界面活性剤ベースのアプローチと高速遠心分離ベースのアプローチの組み合わせを使用して、U937単球から細胞内画分を分離することを実証しています。この方法は、画分間の汚染を最小限に抑えながら、哺乳類細胞の核、細胞質、ミトコンドリア、および原形質膜成分の単離を容易にします。

Protocol

1. バッファーと試薬の調製 ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤の新鮮な溶液を調製する。17.4 mgのフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)を1 mLの100%エタノールに加え、100 mMストックを調製します。注意: PMSFを取り扱うときは、摂取または吸入したり、皮膚や目に触れたりすると危険であるため、保護具を着用してください。目や皮膚に腐食性があります。 ?…

Representative Results

この手順の概略フローチャート(図1)は、懸濁液中で増殖したU9375細胞を首尾よく分画するために取られたステップを視覚的に要約する。等量(1mL)の等密度勾配の上部から採取した画分は、ミトコンドリア画分および膜画分の精製を示す(図2)。ミトコンドリア外膜に局在するタンパク質であるVDACに対する抗体を利用する<sup class="xref"…

Discussion

この方法は、高速遠心分離を使用せずに細胞内分画を行う以前に発表されたアプローチの修正版です11。この変更された方法は、最良の結果を達成するためにより特殊な機器を必要としますが、より包括的で一貫して再現性があります。

ネクロトーシス中のタンパク質局在の分析のためにミトコンドリアサンプルと膜サンプルを分離することができない…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、NIH R15-HL135675-01およびNIH 2 R15-HL135675-02からT.J.L.へのサポートを受けました。

Materials

Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

参考文献

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記事を引用
McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

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