概要

ペプチドマトリックスに基づくHBV特異的CD4 T細胞応答の解析とHLA-DR制限CD4 T細胞エピトープの同定

Published: October 20, 2021
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概要

B型肝炎ウイルス(HBV)由来のペプチドマトリックスに基づいて、HBV特異的CD4 T細胞応答をHBV特異的CD4 T細胞エピトープの同定と並行して評価することができた。

Abstract

CD4 T細胞は、慢性B型肝炎の病因において重要な役割を果たす。多目的な細胞集団として、CD4 T細胞は、彼らが分泌したサイトカインに基づいて明確な機能的サブセットとして分類されている:例えば、CD4 Tヘルパー1細胞のIFN-γ、CD4 Tヘルパー2細胞のIL-4およびIL-13、CD4 T濾胞ヘルパー細胞のIL-21、CD4 TヘルパーヘルパーセルのIL-17。B型肝炎ウイルス(HBV)特異的CD4 T細胞を、HBV由来ペプチド刺激後のサイトカイン分泌に基づいて分析すると、HBV特異的CD4 T細胞応答の大きさだけでなく、HBV特異的CD4 T細胞の機能サブセットに関する情報も提供できる。トランスクリプトミクスやメタボロミクス分析などの新しいアプローチは、HBV特異的CD4 T細胞に関するより詳細な機能情報を提供する可能性がある。これらのアプローチは、通常、ペプチド主要組織適合性複合体II多量体に基づいて生じるHBV特異的CD4 T細胞の単離を必要とするが、現在HBV特異的CD4 T細胞エピトープに関する情報は制限されている。HBV由来のペプチドマトリックスに基づいて、HBV特異的CD4 T細胞応答を評価し、慢性HBV感染患者からの末梢血単核細胞サンプルを同時に使用してHBV特異的CD4 T細胞エピトープを同定する方法が開発されました。

Introduction

現在、抗原特異的T細胞を解析する方法は3つあります。最初のアプローチは、T細胞受容体とペプチド(エピトープ)の相互作用に基づいています。抗原特異的T細胞は、ペプチド主要組織適合性複合体(MHC)多体で直接染色することができる。この方法の利点は、下流の転写/メタボロミクス分析に適した、生存可能な抗原特異的T細胞を得ることができるということです。この方法の制限は、特定の抗原に対するエピトープペプチドの同定数が今のところ制限されている間、検証されたエピトープペプチドを必要とするため、特定の抗原に対するT細胞応答全体に関する情報を提供できなかったということです。B型肝炎ウイルス(HBV)特異的CD8 T細胞エピトープと比較して、HBV特異的CD4 T細胞エピトープが少なく、1,2であり現在HBV特異的CD4 T細胞の分析にはあまり適用されない。

第2のアプローチは、抗原ペプチド刺激3後の一連の活性化誘導マーカーのアップレギュレーションに基づく。一般的に使用されるマーカーには、CD69、CD25、OX40、CD40L、PD-L1、4-1BB 4が含まれる。この方法は、ワクチン接種者5、6、ヒト免疫不全ウイルス感染患者7、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2感染患者8、9における抗原特異的T細胞応答を分析するために使用されてきた。ペプチド-MHCマルチマーベースのアッセイとは異なり、この方法は検証されたエピトープによって制限されず、下流の分析のために実行可能な細胞を得ることができます。この方法の制限は、抗原特異的T細胞のサイトカインプロフィールに関する情報を提供できなかったということである。また、いくつかの活性化された抗原非特異的細胞によるこれらの活性化誘導マーカーの発現は、分析におけるバックグラウンドシグナルに寄与する可能性があり、特に標的抗原特異的T細胞が稀である場合に問題となる可能性がある。現在、HBV特異的CD4 Tセル4に対するこの方法の適用は限られている。この方法を利用してHBV特異的CD4 T細胞を確実に分析できるかどうかは、さらなる調査が必要です。

第3のアプローチは、抗原ペプチド刺激後のサイトカイン分泌に基づく。活性化誘導マーカーベースの分析と同様に、この方法は検証されたエピトープによって制限されない。この方法は、抗原特異的T細胞のサイトカインプロファイルを直接明らかにすることができる。この方法の感度は、抗原特異的T細胞のサイトカイン分泌に依存し、試験されるサイトカインの数は通常制限されるので、活性化誘導マーカーベースの方法よりも低い。現在、この方法はHBV特異的T細胞の解析に広く用いられている。HBV特異的T細胞を細胞分泌する細胞は、直接的なex vivoペプチド刺激10、11によってほとんど検出できなかったので、HBV特異的T細胞のサイトカインプロファイルは、通常、10日間インビトロペプチド刺激拡大12、13、14、15、16の後に分析される。マトリックス形態におけるペプチドプールの配置は、抗原特異的エピトープ17,18の同定を容易にするために利用されてきた。ペプチドマトリックスとサイトカイン分泌解析を組み合わせて、HBV特異的CD4 T細胞応答を評価し、HBV特異的CD4 T細胞エピトープを同時に同定する方法が開発された。このプロトコルでは、この方法の詳細が説明されています。HBVコア抗原は、このプロトコルにおけるデモンストレーションの一例として選択される。

Protocol

書面によるインフォームド・コンセントは、研究に含まれる各患者から得られた。この研究議定書は、サウスウエスト病院の医療倫理委員会の事前承認に反映された1975年のヘルシンキ宣言の倫理ガイドラインに準拠しています。 1. HBV由来ペプチドマトリックスの設計 NCBIデータベースからHBVコア抗原のアミノ酸配列をダウンロードします(GenBank: AFY98989.1)。 <li…

Representative Results

サイトカイン分泌CD4 T細胞の頻度は、単一生産者と二重生産者の両方の合計として計算される。 図1に示すように、TNF-α分泌CD4 T細胞の頻度と、バックグラウンドコントロール(DMSO)におけるCD4T細胞(DMSO)のIFN-γ分泌頻度はそれぞれ0.154%と0.013%である。Cd4 T細胞を分泌するTNF-αの頻度と、ペプチドプールCore11に特異的なIFN-γ分泌CD4 T細胞の頻度はそれぞれ0.206および0.017である?…

Discussion

このプロトコルの最も重要なステップは次のとおりです: 1) PBMCの拡張を開始するのに十分な高い生存率の PBMC;2) PBMC拡張に適した環境3) エピトープ同定前のPBMC培養における残留ペプチドプールの完全除去。

このプロトコルの全ての分析は、CD4 T細胞の強い増殖に依存する。一般に、10日の拡張後のPBMCの数は、初期値の2~3倍になります。PBMCの細胞数と生存率は、PBMCsの拡大?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国立自然科学財団(81930061)、重慶自然科学財団(cstc2019j-bshX0039、cstc2019jj-zdxmX0004)、および中国のキーによって支援されました。
感染症に特化したプロジェクト(2018ZX10723203)。

Materials

Albumin Bovine V (BSA) Beyotime ST023
APC-conjugated Anti-human TNF-α eBioscience 17-7349-82 Keep protected from light
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Limit cell clumping
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09126 HLA-DRB1*0803 homozygote
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09121 HLA-DRB1*1202 homozygote
Cell Culture Flask (T75) Corning 430641
Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) Corning 3599 Flat bottom
Cell Culture Plate (96-well, round bottom) Corning 3799 Round bottom
Cell Strainer Corning CLS431751 Pore size 70 μm, white, sterile
Centrifuge Tube (15 mL) KIRGEN KG2611 Sterile
Centrifuge Tube (50 mL) Corning 430829 Sterile
Centrifuge, Refrigerated Eppendorf 5804R
Centrifuge, Refrigerated Thermo ST16R
Centrifuge, Refrigerated Thermo Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) BD Biosciences 562574 Prepare solution before use
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 Keep at room temperature to prevent crystallization
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave.
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-03
Filter Tips (0.5-10) Kirgen KG5131 Sterile
Filter Tips (100-1000) Kirgen KG5333 Sterile
Filter Tips (1-200) Kirgen KG5233 Sterile
FITC-conjugated Anti-human CD4 BioLegend 300506 Keep protected from light
Fixable Viability Dye eFluor780 eBioscience 65-0865-14 Keep protected from light
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD Biosciences 554724 Protein Transport Inhibitor
Haemocytometer Brand 718620
HBV Core Antigen Derived Peptides ChinaPeptides
HEPES Gibco 15630080 100 ml
Human Serum AB Gemini Bio-Products 100-51 100 ml
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
KCl Sangon Biotech A100395-0500
KH2PO4 Sangon Biotech A100781-0500
LSRFortessa Flow Cytometer BD
L-glutamine Gibco 25030081 100 ml
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Corning MCT-150-C Autoclaved sterilization before using
Microplate Shakers Scientific Industries MicroPlate Genie
Mitomycin C Roche 10107409001
Na2HPO4.7H2O Sangon Biotech A100348-0500
NaCl Sangon Biotech A100241-0500
PCR Tubes (0.2 mL) Kirgen KG2331
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 BioLegend 300914 Keep protected from light
PE-conjugated Anti-human IFN-γ eBioscience 12-7319-42 Keep protected from light
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122 100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 eBioscience 45-0037-42 Keep protected from light
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585
Recombinant Human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant Human IL-7 PeproTech 200-07
RPMI Medium 1640 Gibco C11875500BT 500 ml
Sodium pyruvate,100mM Gibco 15360070
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR BioLegend 307648
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1125

参考文献

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記事を引用
Xiao, J., Wan, X., Wang, H., Deng, G. Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix. J. Vis. Exp. (176), e62387, doi:10.3791/62387 (2021).

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