概要

鞘翅目典礼における精巣融合の顕微外科的閉塞

Published: July 16, 2021
doi:

概要

アルミニウム箔は、精巣の融合を妨げるために 、Spodoptera litura の精巣の間に微小外科的に挿入された。この手順には、凍結、固定、消毒、切開、バリアの配置、縫合、術後の摂食、および検査が含まれる。このアプローチは、組織形成を妨害する方法を提供する。

Abstract

RNA干渉(RNAi)のような遺伝的方法や、規則正しく間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)/CRISPR関連エンドヌクレアーゼCas9などの遺伝的方法を使用する代わりに、物理的な障壁を Spodoptera litura の精巣間に微小外科的に挿入し、この微小手術がその成長と生殖に及ぼす影響を研究した。精巣間にアルミ箔を挿入した後、変態中の昆虫の脱皮は正常に進行した。昆虫の成長と発達は著しく変化しなかった。しかし、精巣融合が顕微手術によって停止された場合、精子束の数は変化した。この新知見は、精巣融合を遮断することが男性の生殖能力に影響を与える可能性があることを示唆している。この方法は、特定のシグナル伝達経路の機能を研究するために、器官間の通信を遮断するためにさらに適用することができる。従来の手術と比較して、マイクロサージャリーは凍結麻酔のみを必要とし、二酸化炭素麻酔よりも好ましい。マイクロサージャリーはまた、手術部位面積を最小限に抑え、創傷治癒を促進する。しかし、特定の機能を持つ材料の選択は、さらなる調査が必要です。組織損傷を避けることは、手術中に切開を行う際に重要です。

Introduction

融合は、組織または器官の発達における一般的な現象である。例としては、ショウジョウバエ1および口蓋形態形成における背部閉鎖および胸郭閉鎖、マウスおよびニワトリにおける神経管形態形成、ならびに心臓形態形成2が含まれる。CRISPRとRNAiは、融合の過程における遺伝子の役割を調べるために応用されています2,3,4

スポドプテラ・リチュラ(S. litura, 鱗翅目: Noctuidae)は、中国を含むアジアの熱帯および亜熱帯地域に広く分布している有害な多食性害虫である4,5,6S. lituraの広い分布は、生殖腺の発達に関連するその強力な生殖能力に部分的に起因しています。男性不妊症は、この害虫を防除するための1つのアプローチです。精巣構造の模式図に示すように、精巣は精巣鞘によって囲まれ、外鞘(腹膜鞘)および内側基底薄板を含む。基底薄層は内部に伸びて濾胞上皮を形成し、精巣の内側領域を卵胞という名前の4つのチャンバーに分離する(図1)。

卵胞では、精子は有糸分裂と減数分裂の後に精子に発達し、精子嚢内の精子は同じ方向に整列して精子束を形成します7。精子形成の間、初代精子細胞はユーピレン精子またはアピレン精子に分化する。幼虫期の精子細胞は、細長い核の頭部に接続された長い尾を有するユーピレン精子に発達する。これらは卵を受精させることができます。逆に、蛹期半ばの精子細胞は、廃棄された核を有するアピレン精子に発達する。これらの精子は、ユーピレン精子の生存、運動、受精を助ける9,10。蛹の6日目は、精巣が豊富なユーピレンとアピレンの精子束を有する期間である。

Figure 1
図1:鱗翅目昆虫の精巣構造の模式図11この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

精巣融合は、鱗翅目秩序のほとんどの昆虫11,12、特に農業害虫である種において起こる。精巣融合は、幼虫期に両側に成長し、互いに接近して接着し、最終的に単一の生殖腺11に統合する一対の精巣を指す。スポドプテラ・リチュラでは、幼虫から蛹期への変態中に起こる。5齢(L5D1)の1日目から6齢(L6D4)の4日目まで、精巣のペアは徐々にサイズが大きくなり、色は象牙白色から淡黄色に変わります。蛹期(L6D5~L6D6)に達するとかすかな赤色になります。2つの両側対称精巣は、蛹準備段階で互いに接近し、1つに融合し、反時計回り(肩面図)にねじれて、蛹期と成虫期に単一の精巣を生成する11。この現象は、経済的にかなり重要であり、5000年間家畜化されてきたカイコでは発生しません13。したがって、精巣の融合は生殖能力を改善すると仮定される。

Spodoptera litura testicular fusionの重要性を決定するには、このプロセスをブロックする効果を調べることが重要です。このプロトコルでは、精巣の間にアルミニウム箔を微小外科的に挿入して分離させ、その結果として昆虫および精巣の発生の変化を研究した。

Protocol

1. 昆虫の飼育と維持管理 スポドプテラ典礼幼虫を人工食を用いた環境シミュレーションチャンバーで、6齢(L6D4)の4日目に達するまで培養する。ワームが第6齢(L6D0)の初日に入ったときに、第8腹部の逆三角形の構造に基づいて雄幼虫を選択します14。注:幼虫の飼育と維持技術は以前に公開されました4,14</…

Representative Results

鞘翅目典礼の成長と発達に対するマイクロサージャリーの影響マイクロサージャリーは背側幼虫表皮に長さ2mmの傷を残し、最終的に血リンパ液の漏出を止めて治癒した。幼虫は蛹前期と蛹期を経て閉鎖され、マイクロサージャリーが成長と発達に大きな影響を及ぼさなかったことを示している。幼虫が蛹に脱皮したとき、縫合糸は表皮とともに…

Discussion

Spodoptera lituraの精巣融合を微小外科的に妨害した後、精子束の数は減少し、この融合が生殖能力に有益であるという仮説を支持した。外科的操作は、20世紀初頭以来、昆虫の生理学的発達を研究するために使用されてきた。脳神経が昆虫の変態によって調節されているかどうかを判断するために、一部の研究者は、異なる昆虫(半翅目のロドニウス・プロリクサス、鱗翅目…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学財団(Nos.:31772519、31720103916;)と、南西大学カイコゲノム生物学国家キーラボラトリー(No.:sklsgb2013003)からの公開助成金によって支援されました。

Materials

75% Rubbing alcohol Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd Q/370285HNW 001-2019
Colored Push Pins Deli Group Co.,LTD 0042
Corneal Scissors Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd MR-S221A Curved and blunt tip
Glad Aluminum Foil Clorox China(Guangzhou) Limited 831457 10 cm*2.5 cm*0.6
Medical Cotton Swabs (Sterile) Winner Medical Co., Ltd. 601-022921-01
Medical Iodine Cotton Swab Winner Medical Co., Ltd. 608-000247
Needle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J32030 14 cm fine needle
Sterile surgical blade Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD #11
Suigical Blade Holder Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD K6-10 Straight 3#
Suture thread with needle Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm
Tying Forceps Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd MR-F201T-3 Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head

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記事を引用
He, X., Ma, Q., Jian, B., Liu, Y., Wu, Q., Chen, M., Feng, Q., Zhao, P., Liu, L. Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura. J. Vis. Exp. (173), e62524, doi:10.3791/62524 (2021).

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