微小重力下での歯科および呼吸器細胞および臓器の増殖

重力は、個々の細胞の生物学や生物内でのそれらの機能など、地球上の生命のあらゆる側面に影響を与えます。細胞は機械受容器を通して重力を感知し、細胞骨格構造を再構成し、細胞分裂を変化させることによって重力の変化に応答します^1,2,3。微小重力の他の影響には、流体で満たされた小胞の静水圧、細胞小器官の沈降、および浮力による流れと熱の対流が含まれます⁴。人間の細胞や臓器に対する重力の喪失の影響に関する研究は、もともと宇宙飛行ミッション中に宇宙飛行士の無重力環境をシミュレートするために行われました⁵。しかし、近年、微小重力をシミュレートするためにNASAによって最初に開発されたこれらの3Dバイオリアクター技術は、他の方法では2D培養システムには適さない細胞集団の培養のための新しいアプローチとしてますます関連性が高まっています。

3Dバイオリアクターは、浮遊状態で細胞を成長させることによって微小重力をシミュレートし、一定の「自由落下」効果を生み出します。回転バイオリアクターの他の利点には、臓器培養システムで遭遇する空気曝露の欠如、せん断応力と乱流の減少、および変化する栄養素の供給への継続的な曝露が含まれます。ロータリー細胞培養システム(RCCS)バイオリアクターによって提供されるこれらの動的条件は、単一細胞の凝集体への空間共局在および三次元アセンブリに有利に働く^6,7。

これまでの研究では、骨再生⁸、歯胚培養⁹、およびヒト歯包細胞の培養¹⁰に対する回転式バイオリアクターの利点が実証されています。RCCSがEOE細胞の増殖とアメロブラストへの分化を促進することを示唆する報告もあります¹¹。しかし、分化した細胞は、アメロブラスチン免疫蛍光および/またはアメロゲニン発現のみに基づいてアメロブラストと見なされました¹¹ 、その細長い形態や分極した細胞形状は考慮されていませんでした。

NASAが開発した回転壁船(RWV)バイオリアクターに加えて、細胞から3D凝集体を生成する他の技術には、磁気浮上、ランダム位置決め機(RPM)、およびクリノスタット¹²が含まれます。磁気浮上を達成するために、磁性ナノ粒子で標識された細胞は、外部磁力を用いて浮上され、その結果、脂肪細胞構造のバイオファブリケーションに使用されてきた足場のない3D構造が形成される¹³、^14、15。微小重力をシミュレートする別のアプローチは、2つの軸を中心とした同時回転を制御することにより、多方向のG力を生成し、クリノスタット¹⁶と呼ばれる装置の中心での累積重力ベクトルをキャンセルすることです。骨髄幹細胞をクリノスタットで培養すると、骨芽細胞分化の抑制を通じて新たな骨形成が抑制され、微小重力の脱分化効果の1つが示されています¹⁶。

アメロブラストの忠実な培養を促進するためのin vitroシステムは、歯のエナメル質組織工学¹⁷に向けて大きな前進をもたらすでしょう。残念ながら、今日まで、アメロブラストの文化は挑戦的な事業でした^18,19。これまでに、マウスアメロブラスト系譜細胞株(ALC)、ラット歯科上皮細胞株(HAT-7)、マウスLS8細胞株²⁰、ブタPABSo-E細胞株21およびラットSF2-24細胞株²²を含む5つの異なるアメロブラスト様細胞株が報告されている。しかし、これらの細胞の大部分は、2D培養で独特の分極細胞形状を失っています。

本研究では、間葉系前駆細胞と共培養した子宮頸管ループ上皮からのアメロブラスト様細胞の増殖を促進し、栄養素の流れの減少や重力による細胞骨格の変化など、2D培養システムの課題を克服するために、回転細胞培養バイオリアクターシステム(RCCS)に目を向けました。さらに、RCCSは、歯周組織工学に関連する細胞/足場相互作用の研究、およびin vitroでの肺胞組織に対する炎症メディエーターの影響を調べるための新しい手段を提供しました。これらの研究の結果は、分化した上皮の増殖、および細胞/足場の相互作用や炎症状態に対する組織反応など、 in vitroで増殖した細胞に対する環境影響の評価に対する微小重力ベースの回転培養システムの利点を強調しています。

研究がTAMU施設の動物管理ガイドラインに準拠していることを確認するために必要なすべての機関承認が得られました。

1.バイオリアクターの組み立てと滅菌

1. バイオリアクター用の4つの高アスペクト比容器(HARV)を、メーカーの推奨に従って、プラスチック機器サイクルのオートクレーブで121°Cで20分間滅菌します。
2. 滅菌後、バイオリアクターに付属のネジを締めて細胞培養フード内で容器を組み立て、容器を使用できるようになります。

2. バイオリアクター共培養実験に用いた足場

1. 足場を細胞と一緒にインキュベートして、さらなる成長に必要な細胞接着をサポートします。
2. 共培養研究用のPGAベースの足場、ハイドロキシアパタイト足場、グラフェンシート、ゼラチンディスク、コラーゲンベースの足場からお選びください。

3. 子宮頸管ループ(CL)解離とシングルセル調製

1. CO2過剰摂取による呼吸停止後の断頭によってマウスを屠殺する。
   注:すべての動物実験は、TAMU施設の動物管理ガイドラインに準拠しています。
2. 以前に公開されたプロトコル²³の修正バージョンに従って、生後6日目(DPN)マウスから頸部ループを解剖します。
   注:私たちの研究では、以前に公開されたプロトコルには示されていない頸部ループの遠位部分が含まれています(図3)。
   1. 解剖した組織を冷滅菌PBSで洗浄してから、コラゲナーゼディスパーゼで37°Cで30分間消化します。
3. 溶液を70 μmの滅菌セルストレーナーに通し、さらに800 x g で10分間遠心分離します。
4. 上澄み液を捨てる。ペレットを遠心分離し、800 x gの冷たいPBSで2回洗浄します。上澄み液を捨てる。
5. 血球計算盤を使用して細胞をカウントし、血管あたり1 X 10⁵ 細胞を追加します。

4. 歯髄細胞培養と細胞株拡大

1. 100mm組織培養プレート中の歯髄細胞を継代4で1×10の濃度で⁵で平板化する。
2. 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%抗生物質/抗真菌剤(P/S)を添加したDMEM高グルコース培地からなる培養用培地を調製します。
3. 細胞が85〜90%のコンフルエントに達したら、培地を吸引し、予熱したPBSでプレートを2回洗浄します。
4. PBS洗浄後、予め温めた0.25%トリプシン-EDTA溶液をプレートに加え、歯髄細胞含有プレートを37°Cで3分間インキュベートします。
5. 顕微鏡による目視検査により細胞剥離を確認します。
6. 培養プレートから細胞とともに培地を回収し、25 mLピペットを介して50 mL滅菌コニカルチューブに移します。
7. 細胞を800 x g で8分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞を新鮮な培地に再懸濁し、血球計算盤を使用してカウントします。
8. 頸部ループ細胞との共培養では、歯髄細胞をバイオリアクターに1容器あたり1 x 10⁴ の濃度で播種します。

5. RCCSバイオリアクター内の足場上での頸部ループ/歯髄細胞の共培養

1. 細胞型、頸部ループ、歯髄の両方を、成長因子、細胞外マトリックスタンパク質、足場を補充したケラチノサイトSFM培地を含む培養培地に追加します。
   注:成長因子は、0.03 μg/mLの骨形成タンパク質2(BMP 2)、0.03 μg/mLの骨形成タンパク質4(BMP-4)、10 ng/mLのヒト組換え線維芽細胞増殖因子(hFGF)および15 ng/mLの上皮成長因子(hEGF)の濃度で添加され、ECM成分には200 μg/mLのマトリゲル、5 μg/mLのラミニン、5 μg/mLのフィブロネクチンが含まれていました。
2. 1 mgのLLAP(ロイシンリッチアメロゲニンペプチド)ペプチド、ブタの歯²⁴から調製した1 mgの凍結乾燥初期段階エナメルマトリックス、5 μg/mLのラミニン、および5 μg/mLのフィブロネクチンで強化された500 μLのコラーゲンゲルの混合物で足場をコーティングします。
   注:これは私たちの実験に最適でした。
3. 足場コーティングに続いて、細胞と足場の両方をバイオリアクターに追加し、バイオリアクターに容器あたり10 mLの培地を充填します。
4. 培地、細胞、および足場を追加した後、バイオリアクター容器の充填ポートキャップを閉じます。
5. 実験の開始時に滅菌バルブをシリンジポートに取り付け、実験が終了するまでカバーで所定の位置に保ちます。
6. 容器が90%いっぱいになり、充填ポートキャップを閉じて締めたら、滅菌バルブを開きます。
7. 培地交換が必要になるたびに、2本の滅菌シリンジ(3 mL)を使用してください。一方のシリンジに新しい培地を入れ、もう一方のシリンジを空のままにします。
8. 両方のシリンジバルブを開き、空のシリンジポートに向かって泡をそっと操作します。
9. フルシリンジからの新鮮な培地が容器に注意深く注入されたら、空のシリンジポートから気泡を取り除きます。
   注意: この手順は、すべてのマイクロバブルが血管から除去されるまで実行されます。
10. シリンジポートをキャップで閉じ、シリンジを鋭利な廃棄物容器に廃棄します。
11. 各容器を回転子ベースに取り付け、回転子ベースを5%_CO2 および37°Cの温度のインキュベーターに入れます。
12. 電源を入れ、回転数を10.1rpmに設定します。
    注意: 速度を調整して、足場が容器の壁に触れずに吊り下げられるようにします。
13. 培地を交換するには、血管を直立位置に置き、細胞が底部に定着するようにします。シリンジポートを開き、滅菌シリンジをポートに接続します。
14. 同じ手順に従って、栄養が枯渇した培地の75%を吸引し、もう一方のポートから新しい培地を注入します。

6.肺臓器調製およびバイオリアクターベースの培養

注:E15野生型マウスの子犬は、肺器官の準備に使用されました。

1. 妊娠中の雌マウスを_CO2 窒息で安楽死させた後、肺組織を解剖する。
   1. 頸部脱臼による窒息後に死亡が確認されたら、メスを使用して胸腔を露出させます。その後、子犬を子宮から取り出し、斬首して安楽死させます。
2. 安楽死させた後、胸腔を開いて肺の位置を特定します。肺組織の小さな部分を滅菌PBSで洗浄し、5%_CO2 および37°Cの温度を含むインキュベーター内の臓器培養培地で2時間滅菌済みメンブレンに置きます。
3. 肺組織が2D臓器培養プレートの膜に付着したら、サンプルをバイオリアクター容器に移します。
4. 培養用の培地を準備します。
   注:コントロールDMEM高グルコース培地には、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%抗生物質溶液(P / S)(ペニシリン、100 U / mL、ストレプトマイシン、50 μg / mL)および100 μg / mLアスコルビン酸(AA)が含まれており、炎症状態の誘発のために、コントロール培地には5 ng / mLのIL-6タンパク質が補充されています。
5. 上記のようにバイオリアクターで48時間毎に培地交換を行い10日間の肺培養実験を実施する。

7.ヒト歯周靭帯(hPDL)細胞培養によるコーティングされた足場

1. ヒト歯周靭帯細胞を培養する。
   注:細胞は、以前に公開されたプロトコルに従って、ラボで単離および培養されます²⁵。
2. コラーゲン足場ディスクを対照群用の30 μLのPBSと神経ペプチドガラニン(GAL)で10^〜8 の濃度で一晩コーティングします。
3. コントロールおよびGALコーティングされた足場材上にヒトPDL細胞を培養プレートに播種し、細胞播種した足場を上記のようにバイオリアクター容器に移した。
4. 細胞播種したスキャフォールドをバイオリアクターで14日間培養してから、分析のためにスキャフォールドを回収します。

8.バイオリアクターの洗浄とメンテナンス

1. バイオリアクターから足場/細胞を回収した後、シリンジポートを容器から取り外します。
   注意: 容器の周りのネジを外し、容器を石鹸水でやさしく洗います。
2. 容器をきれいな水ですすぎ、もう一度ネジを締めます。
3. オートクレーブ処理後、次の使用まで容器を保管してください。

バイオリアクターの内部チャンバーは、細胞が増殖および分化したり、足場に付着したり、集まって組織のような集合体を形成するための環境を提供します。各HARV容器は最大10 mLの培地を保持し、栄養素の一定の循環を促進するため、各細胞は生き残る絶好の機会を得ることができます。図1Aは、滅菌ワンストップバルブが取り付けられている容器の前面プレートへのシリンジポートの取り付けを示しています。これらのバルブは、培養室へのドアキーパーとして機能します。培地交換では、新鮮な培地を含む滅菌シリンジの取り付けを容易にするために、ストップコックバルブを開く必要があります。バイオリアクター内の微小重力環境により、細胞は足場への事前の播種を必要とせずに容器内の足場に付着することができます。バイオリアクターに配置された足場(図1Bおよび1C)は連続的に回転し、細胞が足場表面に付着して細胞骨格ネットワークを形成することを可能にします。容器プレートの底部にある酸素発生器膜(図1B)により、連続的なガス交換が可能になり、細胞の生存と寿命が向上します。

様々な足場を試験して、細胞と最も適合性のある足場を同定した。図2Aおよび2Bの足場は、75%のグラフェンと25%のPLG(ポリ乳酸グリコリド)で構成されるグラフェンシートです。この導電性足場は、骨格筋細胞26などの電気刺激を必要とし得る細胞に頻繁に使用される。私たちの研究では、コラーゲン足場は、生体適合性、組織成長の促進、細胞分化の点でテストされた他のすべての研究を上回りました。このコラーゲンベースの足場の特殊な多孔質表面(図2Cおよび2D)により、細胞と栄養素が足場全体に流れ、細胞の付着と増殖の領域が増加します。

マウスの下顎骨に対する頸部ループの位置を図3Aおよび3Bに例示する。マウス切歯頸部ループ細胞を作製するために、骨格化したマウス下顎骨を解剖し、マウス下顎切歯の最遠位部分を露出させた。切除された頸部ループの正確な位置は、生後6日目のマウス切歯で画定されていますが(図3B)、成体の骨格化マウス下顎骨の同様の領域は、オリエンテーションの目的で図3Aの参照として提供されています。スケルトン化された成体(図3A)および6dpnの新たに調製されたマウス切歯における対応する頸部ループの領域は、2本の破線(図3AおよびB)で囲まれている。下顎半歯の歯列は、3つの下顎大臼歯と継続的に成長する切歯で構成され、頸部ループ細胞ニッチは、内エナメル質上皮、外エナメル質上皮、星状網、層間中などのエナメル質形成に関与する混合細胞集団で構成されています19。

図4は、子宮頸管ループ細胞を細長い分極したエナメルタンパク質分泌アメロブラスト様細胞に分化させることに成功したことに焦点を当てています。骨髄芽球様細胞を分泌する細長い分極したエナメル質タンパク質の分化を成功させるには、頸部ループ細胞と歯髄幹細胞などの間葉系幹細胞との共培養が必要であることが明らかになりました。培養細胞には、プロトコルのステップ3に記載されているように調整された微小環境が提供され、その結果、アメロブラストの典型的な特徴である、一方の端に核があり、もう一方の端に長い細胞プロセスを持つ分極細胞が形成されました27(図4A)。培地を単独で適用し、成長因子および/または足場コーティングなしで適用すると、重要なエナメル質タンパク質を分泌するが、伸長または分極しない子宮頸部ループ細胞が得られました(図4B)。

ガラニンコーティングおよび非コーティングコラーゲン足場を、バイオリアクター内のhPDL細胞を含むバイオリアクターに14日間配置しました。細胞は3D培養系で2週間の培養期間を生き延び、ガラニン被覆足場群は、被覆されていない足場を含む対照群(図5A)と比較して有意に高い増殖率(図5B)を示した。実験群の細胞はまた、対照と比較して結合組織繊維を含む有意に高いレベルの細胞外マトリックスを示した。

バイオリアクター環境は、3D微小重力環境での肺セグメントの成長に成功したことが証明されました(図6)。この研究のために、E15マウスから採取した肺組織セグメント(図6C)を臓器培養皿のニトロセルロース膜上に2時間置いた。膜への最初の組織付着に続いて、肺組織/ニトロ細胞膜複合体をバイオリアクター容器に入れ、10日間の培養に成功しました(図6A)。肺組織の成長に対する炎症状態の影響を研究するために、培養培地へのIL-6の添加は、 in vivoで 見られるものと同様の肺胞形態の典型的な炎症関連変化をもたらしました(図6B)。

図 1.バイオリアクター容器の構成要素。 図1は、バイオリアクター容器の主要コンポーネントと、組み立て前の段階での位置を示しています。(A)反応器室、シリンジポート、足場の相対位置。(B)前面プレート(クリアカバー)とバックプレート(酸素発生器膜で覆われた白いプレート)の半開位置。足場は前面プレートと背面プレートの中央に配置されています。黒色のグラフェン足場(C)は、足場が容器内に配置され、細胞が増殖、分化、および細胞ネットワークを形成するための支持体として使用される方法を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.本研究で試験した足場の代表的な図。 バイオリアクター研究のために5つの足場がテストされ、そのうち2つの例がここに示されています。(A、B)はアメロブラスト様細胞増殖について試験されたグラフェン足場を表し、(C、D)はバイオリアクターベースの細胞培養研究に最も成功したコラーゲン足場を表します。コラーゲン足場(C、D)の多孔質構造と、グラフェン足場(A、B)の表面エンボス加工の平行配列に注意してください。(A,C)は垂直な視点から撮影したマクログラフで、(B,D)は45°の角度で撮影したものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.頸部ループの準備。 Aのスケルトン化された成体マウス下顎骨は、アメロブラスト様細胞の培養と分化のための細胞ニッチを準備するために使用される頸部ループ領域を示しています。このマクログラフはまた、下顎のほぼ全長にわたって継続的に成長する切歯(inc)、下顎骨の角度、冠状突起および下顎頭の位置とともに、第1下顎大臼歯(m1)を含む解剖学的マーカーの位置を示す。この骨格製剤は、(B)で調製した頸部ループ領域の解剖学的配向として機能する。基準点には、下顎骨(下顎)、歯乳頭組織(DP)、下顎骨の角度(角度)、およびアメロブラストバイオリアクター研究用の細胞を採取した頸部ループ(CL)の位置が含まれます。破線は、骨格化した成人下顎骨(A)および6 dpnの新たに解剖された下顎(B)における頸部ループ解離のために準備された開窓下顎窓の前部および遠位部を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 4.3D共培養アプローチを用いたアメロブラスト様細胞の作製。 (A)適切な微小環境下で歯髄幹細胞と共培養した頸部ループ細胞からアメロブラスト様細胞の分化に成功。得られた細胞集団は、エナメル質マトリックスタンパク質を分泌する能力を有する長くて細長い分極細胞で構成されていた。これらの細胞は、一方の端に核(核)があり、もう一方の端に真のアメロブラストで観察されるようなトメスプロセスに似た細胞突起(proc)を備えていました(A)。(B)は、同じく共培養条件に供されたが、成長因子または分化剤を含まない培地を用いた対照群細胞の集団を示し、典型的なアメロブラストを代表しない丸みを帯びた細胞をもたらす。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 5.コーティングされた足場表面とコーティングされていない足場表面を持つ単一細胞歯周前駆細胞(pdl)集団の長期3D培養。スキャホールドコーティングは、非コーティングスキャホールド(A)に曝露された対照群細胞と比較して、ガラニンコーティングスキャホールド(B)上で培養された細胞におけるhPDL細胞増殖速度の増加をもたらした。実験群からの細胞はまた、対照群と比較して結合組織繊維を含むより多くの細胞外マトリックスを分泌した(B対A)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 6.バイオリアクターでの肺組織培養。 (a)E15肺組織セグメントをバイオリアクター内のニトロセルロース膜上で10日間培養する。(B)E15(A)と同様の肺組織セグメントを培地(B)にIL-6を添加して炎症状態に供する。(C)H&Eで染色された新たに解剖されたE15肺組織のパラフィン切片(A)と(C)を比較すると、肺胞I型とII型の細胞形態の類似性に注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者は開示する利益相反を持っていません。