概要

ウサギモデルにおける孤立した肺灌流システム

Published: July 15, 2021
doi:

概要

孤立したウサギの肺の準備は肺の調査の金の標準的な用具である。この出版物は、気道反応性、肺保存、肺移植および肺水腫における前臨床研究に関与する生理学的および病理学的メカニズムの研究のために開発された技術を説明することを目的とする。

Abstract

孤立した肺灌流システムは肺の研究で広く使用されており、肺の内部の働き(マイクロおよびマクロ的)の解明に寄与している。この技術は、循環物質間の相互作用や吸入または浸透物質の影響を含む代謝活動および呼吸機能を測定することによって、肺生理学および病理の特性評価に有用である。 in vitro の方法は組織のスライスと培養を伴うが、孤立した ex vivo 肺灌流システムは、換気および灌流を再現しながら、連続的な生理機能の研究を可能にする完全な機能器官で働くことを可能にする。しかし、中枢的な内挿およびリンパドレナージの欠如の影響は、依然として十分に評価されなければならないことに留意すべきである。このプロトコルは、孤立した肺装置の組み立てを記述し、実験用実験動物からの肺および心臓の外科的抽出およびカヌル化を記述し、また、データの灌流技術および信号処理を表示することを目的とする。孤立した肺の平均生存率は5〜8時間の範囲である。この間、肺毛細血管の透過性が増加し、浮腫および肺損傷を引き起こす。保存された肺組織の機能は、毛細管濾過係数(Kfc)によって測定され、経時肺水腫の程度を決定するために使用される。

Introduction

ブロディとディクソンは、1903年1月に最初に元生体肺灌流システムを説明した。それ以来、肺2,3の生理学、薬理学、毒物学、生化学を研究するためのゴールドスタンダードツールとなっています。この技術は、肺移植の生存率を評価し、ヒスタミン、アラキドン酸代謝物、物質Pなどの炎症性メディエーターの効果と、気管支収縮、アテクサシス、肺水腫などの肺現象中の相互作用を決定するための一貫した再現可能な方法を提供する。孤立した肺系は、一般的な循環からの生物起源アミンの除去における肺の重要な役割を明らかにする上で重要な技術であった4,5。さらに、このシステムは、肺界面活性剤の生化学を評価するために使用されています6。過去数十年にわたり、元生体肺灌流システムは肺移植研究のための理想的なプラットフォームとなっています7。2001年、スティグ・スティーンのチームリーダーは、元生体肺灌流システムの最初の臨床応用を説明し、19歳のドナーの肺を再調整し、最初に怪我のために移植センターによって拒絶された。左肺は収穫され、65分間浸透した。その後、COPD8を持つ70歳の男性に移植に成功しました。元生体灌流を用いた肺再調節のさらなる研究は、負傷したドナー肺を評価し、治療するための拡張肺灌流のためのトロント技術を開発することにつながった9,10。臨床的には、元生体肺灌流システムは、標準下のドナー肺を治療および再調整することによってドナープールを増加させる安全な戦略であることを示しており、標準基準ドナー10に対するリスクまたは結果に有意な差を示さない。

孤立した肺灌流システムの主な利点は、実験パラメータが人工実験室のセットアップの下でその生理機能を維持する完全な機能器官で評価することができるということです。さらに、肺の機械的換気の測定と操作により、肺生理学の成分(気道抵抗、全血管抵抗、ガス交換、浮腫形成など)を分析することができ、現在までにはラボ動物 の生体内で正確に 測定することはできません2。特に、肺が浸透する溶液の組成を完全に制御することができ、物質の添加は、リアルタイムでそれらの効果を評価し、さらなる研究のための灌流からのサンプル採取を可能にする11。孤立した肺系を扱う研究者は、機械的換気が肺組織の崩壊を引き起こし、その有用な時間を短縮することを念頭に置くべきである。この機械的パラメータの進行性の低下は、実験中に時折肺を高膨張させることによって著しく遅れることがある4。それでも、準備は通常8時間以上続くことはできません。 元生体肺 灌流系のもう一つの考慮事項は、中枢神経系調節およびリンパドレナージの欠如である。彼らの不在の影響はまだ完全には理解されておらず、特定の実験におけるバイアスの原因となる可能性があります。

分離肺灌流システム技術は、高い一貫性と再現性を有するウサギモデルで行うことができる。この研究は、メキシコシティのインスティトゥート・ナシオナル・デ・エンフェルメダーデス・レスピラトリアスでウサギモデルのために開発された 元生体 単離肺灌流技術の実施のための技術的および外科的処置を説明し、洞察を共有し、この実験モデルの適用における重要なステップに関する明確なガイドを提供することを意図している。

Protocol

ウサギモデルの単離灌流系は、インスティトゥート・ナシオナル・デ・エンフェルメダーデス・レスピラトリアスの気管支過敏性研究所で広く使用されています。プロトコルは、2.5-3キロのおおよその重量を持つニュージーランドのウサギが含まれています。すべての動物は、標準的なビバリウム条件と実験動物のための公式のメキシコのガイドライン(NOM 062-ZOO-1999)および実験動物のケアと?…

Representative Results

孤立した肺灌流システムは、生検のための臓器操作、灌流からのサンプル収集、および生理学的パラメータのリアルタイムデータ収集を可能にする。分離されたシステムは、代謝および酵素活性から肺移植のための浮腫形成および保存期間に、異なる機能および肺現象を含む多くの仮説をテストするために使用することができる。 図1は、完全に組?…

Discussion

この研究は、肺生理学研究に不可欠な技術である孤立した肺灌流システムの一般的なビューを表示する。分離された肺の灌流システムは使用の多様性の大きい程度を提供し、仮説の広い範囲のテストに関連するいくつかの変数の評価を可能にする15。孤立した肺系は、過去10年間に臓器特異的評価との関連性をさらに確立し、間葉系幹細胞16 およびCRISPR/Cas9?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者たちは、この原稿の執筆に対する彼女のサポートに対するベッティーナ・ソマー・セルバンテス博士、イラストによる彼女のサポートに感謝したいと思います。

Materials

2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-1864
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4312
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4312
Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4309
Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4138
Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder sigma 3912 500 g
Calcium chloride, CaCl2·2H2O. JT Baker 10035-04-8
Cryogenic vials Corning 430659 2 mL
D-glucosa, C6H12O6. sigma G5767
Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-3882
Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0064
Eppendorf tubes
Ethanol absolute HPLC grade Caledon
Falcon tubes 14 mL
Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) Hugo Sachs Elektronik (HSE) 70-7001
Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range Hugo Sachs Elektronik (HSE) 59-9349
Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz Hugo Sachs Elektronik (HSE) 59-9703
Heparin PISA 5000 UI
HPLC Column (C18 100A 5U) Alltech 98121213 150 mm x 4.6 mm
Hydrophilic Syringe Filter Millex SLLGR04NL 4 mm
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4296
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4296
Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0322
Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0125
Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4162
Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0020
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O JT Baker 10034-99-8
Microcentrifuge Tube Corning 430909
Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4298
New Zeland rabbits
PISABENTAL (Pentobarbital sodium) PISA Q-7833-215
PLUGSYS Case, Type 603* 7 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0045
PLUGSYS TCM Time Counter Module Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-1750
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0065
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-1793
PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-1755
Potassium chloride, KCl. JT Baker 3040-01
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 JT Baker 7778-77-0
PROCIN (Xylacine clorhydrate) PISA Q-7833-099
Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4161
Scalpel knife
Serotonin 5-HT
Servo Controller for Perfusion (SCP Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-2806
Snap Cap Microcentrifuge Tube Costar 3620 1.7 mL
Sodium bicarbonate, NaHCO3 sigma S6014
Sodium chloride, NaCl. sigma S9888
Surgical gloves No. 7 1/2
Surgical gloves No. 8
Taygon tubes Masterflex
Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4163

参考文献

  1. Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
  2. Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
  3. Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
  4. Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
  5. Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
  6. Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
  7. Machuca, T. N., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 6 (8), 1054-1062 (2014).
  8. Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
  9. Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
  10. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
  11. Kao, C. C., Parulekar, A. D. Is perfusate exchange during. Annals of Translational Medicine. 8 (3), 43 (2020).
  12. Alquicira-Mireles, J. . Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , (2013).
  13. Arreola-Ramírez, J. L. . Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , (2009).
  14. Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE) Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021)
  15. Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
  16. Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
  17. Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
  18. Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
  19. Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
  20. Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).

Play Video

記事を引用
Pacheco-Baltazar, A., Arreola-Ramírez, J. L., Alquicira-Mireles, J., Segura-Medina, P. Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model. J. Vis. Exp. (173), e62734, doi:10.3791/62734 (2021).

View Video