安定化ピン付きマウス大腿骨の横骨折

骨折、骨表面の連続性の切断は、集団のすべてのセグメントで起こる。彼らは老化や病気のために壊れやすい骨を持っている人々で重篤になり、脆弱性骨折の医療費は5年間で250億ドルを超えると予想されています1,2,3,4,5。骨折修復に関与する生物学的メカニズムを理解することは、治癒プロセスを強化することを目的とした新しい治療法を開発する際の出発点となるでしょう。以前の研究では、骨折時に、骨を治癒させる4つの重要なステップが起こることが示されている:(1)血腫の形成;(2)線維軟骨カルスの形成;(3)軟質カルスの石灰化により骨を形成する工程;(4)治癒した骨のリモデリング ^6,7.多くの生物学的プロセスは、骨折を正常に治癒するために活性化される。第1に、急性炎症促進反応が骨折の直後に開始される^6,7。そして、骨膜が活性化・膨張し、骨膜細胞が軟骨細胞に分化して軟骨カルスを形成し、破壊された骨セグメント⁶、^7、8、9によって残された隙間を埋めるために成長する。神経および血管細胞は、新たに形成されたカルスに侵入して、修復を容易にするために必要な追加の細胞およびシグナル伝達分子を提供する⁶、⁷、^8、9、10。カルス形成に寄与することに加えて、骨膜細胞はまた、架橋カルスに織り込まれた骨を横たえる骨芽細胞に分化する。最後に、破骨細胞は、新しく形成された骨を元の形状および層状構造⁷、⁸、⁹、^10、11に戻すように改造^する。多くのグループが骨折修復のマウスモデルを開発した。マウスにおいてより早く、最も頻繁に使用される骨折モデルの1つは、特定の身長から脚に体重を落とすアインホーンアプローチである¹²。角度と骨折を誘発するために加えられる力に対する制御の欠如は、骨の不連続性の位置およびサイズに多くの変動性を作り出す。続いて、観察される特定の骨折治癒応答に変動をもたらす。他の一般的なアプローチは、脛骨単皮質欠損またはストレス骨折を生じる外科的介入であり、比較的穏やかな治癒応答を誘導する手順^{である10、13}。これらのモデルにおける変動性は、主に、手順¹⁴を実施する人によるものである。

ここで、詳細なマウス大腿骨損傷モデルは、再現性のある傷害を提供し、大腿骨骨折修復の定量的および定性的評価を可能にするために、骨折の制御を可能にする。具体的には、成体マウスの大腿骨に完全なブレークスルーが導入され、骨折端を安定させて、骨治癒において物理的負荷が果たす役割を説明する。組織を採取し、組織学およびマイクロコンピュータ断層撮影法(microCT)を用いて治癒プロセスの異なるステップを画像化するための方法も詳細に提供される。

記載されているすべての動物実験は、ハーバード大学医療分野の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。12週齢のC57BL/6Jマウス(雄および雌)をこのプロトコールで使用した。C57BL/6J雄および雌マウスは、安定化ピンに収まるのに十分な幅の大腿骨を有する12週齢前後にピーク骨量を達成し、このプロトコル¹⁵に使用するのに適した株となっている。

1. 手術の準備

1. 外科用はさみ、ストレート鉗子、湾曲した鉗子、外科用クランプ、ダイヤモンドカッティングホイール( 材料表を参照)などの手術器具をオートクレーブして、感染のリスクを最小限に抑えます。
2. 手術後の回復を容易にするために、加熱パッドに清潔なマウスケージを置きます。37〜45°Cの温度に達するようにヒートパッドを設定します。
3. イソフルランチャンバーを用いてマウスを麻酔下に置く。誘導酸素流量を2 L/分、イソフルラン誘導を2~4%、維持ノーズコーン酸素を2 L/分、維持イソフルランを1.4%に設定します。
4. マウスの呼吸が安定しており、つま先のピンチに反応しないことを確認します。角膜引っ掻き傷を防ぐために、各目に眼科用軟膏の薄い層を塗布する。マウスを滅菌パッドに移し、ノーズコーンを使用して麻酔を維持し、ステップ1.3と同じ速度でイソフルランを連続的に送達する。
   注: 12 週齢以上のマウスの使用は、若いマウスの大腿骨が薄すぎて安定化ピンを収容できない可能性があるため、使用することをお勧めします。
5. マウスの皮下に0.05mg/kg体重の徐放性ブプレノルフィンを注射する( 材料表を参照)。
6. 電動トリマーを使用して、大腿骨の位置に対応する両方の太ももに2 x 2cmの正方形を剃ります。
7. 滅菌ガーゼまたは綿棒を使用して剃毛領域を消毒し、ヨウ素の層を広げ、続いて70%エタノールですすぎます(図1A)。

2. 手術

1. 滅菌メスを使用して、剃毛された消毒された領域に5mmの切開を行い、皮膚を剥がして下層の筋膜を露出させる。
2. まっすぐな鉗子と細かいはさみを使って、大腿骨を直接覆う筋膜を繊細につかんで切断し、筋肉を露出させます。筋膜の5mmの切断は、基礎となる筋肉にアクセスするのに十分である。
3. 1組のまっすぐな鉗子を使用して、最小限の組織損傷で筋肉を大腿骨から静かに分離します。
4. 大腿骨が見えたら、分離した筋肉と骨の間に大腿骨の下に湾曲した鉗子をスライドさせます。鉗子をゆっくりと開いて筋肉分離を維持し、大腿骨を固定してきれいな切断を容易にします。
   注: 図 1B に示すように、鉗子が保持されていない場合、大腿骨は露出したままで、筋肉および皮膚から分離された状態を維持する必要があります。
5. 低出力設定のハンドヘルドソーを使用して、大腿骨シャフトの中央に横方向に切断します(ブレードの 材料表 と使用するロータリーツールキットを参照)。
   注:大腿骨が完全に切断されると、近位部(股関節に付着)と遠位部(膝に取り付けられ、窒息関節とも呼ばれる)の2つの骨折端が作成されます。1つの動きで大腿骨を切ることは避けてください。代わりに、大腿骨が完全に切断されるまで3〜5回通過します。これは、周囲の組織を過熱させ、重大な骨破片を生成し、治癒に悪影響を及ぼすのを避けるために重要です。
6. ガイド針(23 G x 1 TW IM、0.6 mm x 25 mm)( 材料表を参照)を遠位部の骨髄腔に挿入する。指を使って針を優しくねじり、膝関節に糸を通します(図1C)。
   1. 遠位端からガイド針を取り外し、近位端で繰り返し、同じ穏やかなねじれ運動を使用してガイド針を股関節に押し込みます。ガイド針を近位端に残し、先端が皮膚から浮かび上がった状態にします(図1D)。
      注:骨折端部を安定させるために、まずガイド針を用いて骨折端を通る経路を作成し、次いで安定化ピンをこの経路に通して骨折端^部14を固定した。
7. 安定化ピン(針、27 G x 1 1/4、0.4 mm x 30 mm)( 材料表を参照)をガイド針の先端に挿入します(図1E)。ガイド針が近位端の骨髄腔から出るときに安定化ピンが入るように静かに押します。
   1. ガイド針を捨てます。ピンセットを使用して遠位端を保持し、近位端に合わせ、2.6で作成した経路を使用して膝関節を出るまで、遠位骨髄腔に安定ピンを通し続けます(図1F)。
      メモ:安定化ピンが股関節と膝関節から突き出ているはずです。
8. 外科用クランプを使用して、ピンの先端を引っ張って近位部と遠位部を近づけ、ほとんど触れないようにします。必要に応じて骨折端を鉗子で再調整し、外科用クランプを使用して安定化ピンの端部を骨折部位に向かって折り畳みます( 材料表を参照)。
   1. ワイヤーカッターを使用して針の付け根からプラスチックを取り外します。クランプを使用して、ピンの両端を鈍くなるまでねじって、内部組織の損傷を防ぎます。
      注:骨折端は、マウスが負傷した脚に体重をかけることができるように、所定の位置にロックされています。フラクチャ端が分離できない場合、ピンは固定されます。ワイヤーカッターを使用して端部を鈍くすることもできます。安定化ピンは、マウスが安楽死するまで、研究の全期間にわたって所定の位置に留まらなければならない。ピンを外そうとする試みは、骨折反応を不安定にし、動物に害を及ぼす可能性があります。ピンは解剖時に取り外すことができます。
9. まっすぐな鉗子を使用して、筋肉を大腿骨に再配置します。湾曲した鉗子を使用して、皮膚の端を一緒につまみ、巻かれたクリップを使用して開口部を閉じます。
   メモ:クリップで皮膚をきつく閉じすぎないでください。そうしないと、マウスはこの脚に体重をかけないようにします。回復中の物理的な負荷を制限すると、回復プロセスが遅れる可能性があります。
10. もう一方の脚にステップ2.2〜2.4を繰り返し、大腿骨骨折を行わずに創傷を閉じる。
    注:この偽操作大腿骨は、対側制御として機能します。
11. イソフルラン曝露を撤回し、マウスを加熱したケージに入れ、10〜15分以内に意識を取り戻すようにする。
12. 苦痛または感染の徴候について、手術後5日間、マウスの活動および切開部位を毎日監視する。
    注:動物が痛みの兆候を示す、食べていない、および/または後肢の上を歩くことを躊躇している場合は、獣医に相談し、追加の鎮痛剤を投与してください。
13. 手術の10日後に創傷クリップを取り外す。
    注:10日経っても傷が閉じていないように見える場合は、クリップを取り外す前に獣医とIACUCに相談してください。

3. 組織採取

1. CO2吸入に続いて子宮頸部脱臼を介してマウスを安楽死させる。
   注:この手順は、米国獣医師会の安楽死に関するパネルと一致しています。
2. はさみと鉗子を使用して、マウスの両脚から皮膚を取り除き、大腿骨頭を股関節骨から脱臼させ、隣接する筋肉を切断して脚を解放します。
   注:カルスが外れたり損傷したりする可能性があるため、大腿骨の周りの筋肉を取り除きすぎないでください。
3. 安定化ピンを避けて、膝関節を切断して大腿骨を脛骨から分離する。
4. 大腿骨の遠位部および近位部の周囲を解剖して、安定化ピンの端部を露出させる。
5. 硬質ワイヤーカッターで、ピンの折り畳まれた鈍い端を切断して、ピンの直線部分だけが残るようにします。鉗子を使用して、安定ピンをゆっくりと静かに大腿骨から引き出します。
   メモ:ピンが簡単にスライドしない場合は、カルスが外れてサンプルが損傷する可能性があるため、力を加えないでください。代わりにピンを回転させて繊細に外してみてください。ピンの取り外しも、固定後に容易になることがあります。

4. 組織学 - アルシアンブルー/エオジン/オレンジG染色

注:アルシアンブルー/オレンジG/エオシン染色は、軟骨(青)と骨(ピンク)を視覚化するために日常的に使用されています。軟骨面積は、全カルス面積に対する割合として定量することができる(図2A、B)。

1. 大腿骨を10%中性緩衝ホルマリン中で4°Cで一晩固定する。
2. 固定サンプルをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄する。
3. サンプルを0.5M EDTA、pH 8.0でゆっくりと回転するシェーカーに2週間置きます。効率的な脱灰を確実にするために、EDTA溶液を1日おきに交換してください。
   メモ:シェーカーに特定のrpmは必要ありません。液体が容器内を流れ、すべてのサンプルを覆うようにします。完全な脱灰は、大腿骨のX線によって試験することができる。
4. パラフィン包埋用のサンプルを処理するために、それらを以下の溶液(それぞれ1時間)中でインキュベートする:70%EtOH、95%EtOH、100%EtOH、100%EtOH、キシレン、キシレン、パラフィン、パラフィン。
5. 切片化のためにサンプルをパラフィンに埋め込む。
6. ミクロトームを用いて骨折した大腿骨の5〜7μm厚の縦切片を切断する。
7. 切片をキシレンの2浴(それぞれ5分)でインキュベートすることによって、切片を脱パラフィン化する。
8. 以下のエタノール勾配(それぞれ2分)でインキュベートすることによって切片を再水和する:100%EtOH、100%EtOH、80%EtOH、70%EtOH。
9. スライドを水道水に1分間入れます。
10. 補足ファイル1に記載されているように、組織学のためにアルシアンブルー、酸性アルコール、アンモニウム水、およびエオシン/オレンジGの溶液を作ります。
    注:各溶液の推奨量は、染色のためにスライドを完全に沈めるのに十分でなければなりません。
11. スライドをアシッドアルコールに30秒間入れ、アルシアンブルーで40分間インキュベートします。
12. 水が澄むまでランニングタップの下で約2分間優しく洗ってください。
13. スライドを酸性アルコールに1秒間急速に浸します。
14. ステップ4.9の説明に従ってすすぎます。
15. アンモニウム水中で15秒間インキュベートする。
16. ステップ4.9の説明に従ってすすぎます。
17. 95%EtOHに1分間入れ、エオシン/オレンジGで90秒間インキュベートする。
18. 70%EtOH、80%EtOH、100%EtOHに1回浸漬してスライドをすばやく脱水します。
19. スライドをキシレンに1分間置いて、スライドをクリアします。
20. 取り付けメディアと、イメージング用のカバースリップを取り付けます。
    注:分子分析のために、RNAおよびタンパク質をカルスから単離することができる。解剖スコープの下で筋肉を慎重に解剖し、メスを使用してカルスを基礎となる骨から分離します。

5. マイクロCT

注:治癒の後期段階では、マイクロCTを実行して、ハードカルスおよび骨折ギャップの石灰化を画像化および定量化することができる。C57BL/6Jマウスでは、カルスは通常石灰化され、骨折後10日後(dpf)にマイクロCTによって検出可能である(図2C)。

1. 大腿骨を10%中性緩衝ホルマリン中で4°Cで一晩固定する。
   注:MicroCTは、EDTA脱灰(ステップ4.3)の前に行われる限り、組織学に使用されるのと同じ大腿骨に対して行うことができる。両方の手法に同じ大腿骨を使用する場合は、microCTを実行し、サンプルを取得してステップ4.3に進みます。
2. 固定サンプルをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、70%EtOHに保存します。
3. 等方性ボクセルサイズ7μm、エネルギー準位55kVP、強度145μAのマイクロCTを行う( 材料表参照)。
4. マイクロCTスライスを輪郭を描き、カルスを含み、皮質骨を除外する。
   注:カルスが時間とともにより鉱化するにつれて、閾値を調整して、異なる段階でカルス体積を視覚化および測定することができる。
5. カルス輪郭に含まれる骨量をカルス体積の測定値として求める。
   メモ:破壊ギャップは、破断が占める距離としてmicroCTスライス上で直接測定できます。

C57BL/6Jマウスでは、手術が成功すれば、偽手術を受けた対側大腿骨への局所炎症反応または骨膜関与がほとんどまたはまったくなく、前述の治癒ステップが完了します。手術の数時間後に血腫が形成され、骨膜が活性化されて軟骨形成のために骨格前駆細胞を募集する。Prx1+ 間葉系前駆細胞などの様々な細胞集団を、市販の蛍光レポーターマウスモデルを用いて修復プロセス中にトレースすることができる(図3)。骨折後5日目(dpf)に、アルシアンブルー染色を使用して軟質カルスを視覚化し、続いて軟骨領域を定量化することができる(図2A、B)。石灰化は、28dpfでマイクロCTによって検出可能である(図2C)。石灰化カルスの体積、骨折間隙の距離、および機械的試験によって測定された骨強度は、骨折修復の定量化可能な結果として一般的に使用される。遺伝子組み換えや薬物介入は回復の過程を変える可能性があるため、修復のさまざまな段階で骨折を特徴付けるためにタイムコース研究を行うことが推奨される。カルス全体を分子分析のために解剖することができ、対側骨軸を対照として使用することができる。 骨折端がピンで整列または適切に固定されていない場合、結果として得られる画像は、骨折部位の全部または片側にカルス形成の欠如を示すであろう(図4)。

図1:安定化ピンの骨折と挿入。 (A)C57BL/6Jマウスの右足に正方形が剃られている。(B)皮膚と筋膜を切開した後、湾曲した鉗子を大腿骨の下に固定し、筋肉、皮膚、骨を分離します。(C)切断が行われた後、2つの骨折端が作成される:股関節骨に取り付けられた大腿骨の近位部および膝に取り付けられた遠位部。ガイドニードル(緑色)を遠位部に挿入し、膝関節に押し込みます。(d)ガイド針を遠位部から取り出し、近位部に挿入し、股関節を貫通する。(E)股関節から突出したガイド針に安定化ピン(灰色の針)を挿入する。(F) 安定化ピンは、Cのガイド針によって作られた経路を使用して、近位部を通って遠位部に、そして膝関節を通って押し込まれます 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:大腿骨骨折の 組織学およびマイクロCT。 (A)大腿骨骨折のホルマリン固定パラフィン切片を5、10、および28dpfで採取し、アルシアンブルー/エオシン/オレンジG.スケールバー= 500μmで染色した。(B)軟骨面積は、ImageJソフトウェアを用いて、5、10、および28dpfで定量化した。(c)28dpfでは石灰化が観察され、カルス体積と破壊ギャップをマイクロCTで測定できた。スケールバー = 1,000 μm。データはSEMの平均として示±。石灰化カルス体積は、骨折部位における皮質骨の周囲を輪郭を描くことによって測定した。濃い灰色の領域は画像上の石灰化したカルスを描写し、皮質骨(明るい灰色)は測定に含まれない。データは [SEM の平均] として表示さ±ています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:骨折後のPrx1+ 骨膜細胞の増殖を可視化するために使用される蛍光レポーターモデル。 Prx1CreER;Rosa26 tdトマトマウスに80mg/kg体重のタモキシフェンを毎日5日間注射し、tdトマト 発現を誘導した。最終注射の3日後、大腿骨骨折を開始し、マウスを7または14dpfで屠殺して、Prx1発現細胞およびその子孫(Prx1+)が骨折カルスおよび拡張骨膜内のどこに位置するかを追跡した。スケールバー = 500 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:外科的問題による不規則な治癒の例。 骨折端部は適切に整列しておらず、この例では安定化ピンが大腿骨の近位部を貫通していた。これらのエラーは、切断部位ではなく大腿骨が穿孔されたカルス形成(黄色の箱)をもたらした。スケールバー = 500 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:組織学に必要な溶液の構成。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは、開示する利益相反を持っていません。