アフリカツメガエル・ラエビス・ オタマジャクシ脊髄切断は、胸部レベルで脊髄を完全に切断する横方向切断を行うことによって脊髄損傷および再生を研究するための関連する傷害方法である。
脊髄損傷(SCI)は永久的な苦痛であり、中枢神経系(CNS)運動および感覚神経に影響を及ぼし、損傷部位の下の麻痺をもたらす。今日まで、SCIに対する機能回復療法はなく、SCI後に起こる多くの複合体および動的事象に関する明確さに欠けている。多くの非哺乳類生物は、テレオスト魚類、ウロデレ両生類、およびアフリカツ メガエル・ラエビス・オ タマジャクシを含むアヌラン両生類の幼虫期など、重度のSCIの後に再生することができる。これらは、SCIに対する応答と成功した再生プロセスの根底にあるメカニズムを研究し、理解するための正真正銘のモデル生物です。この種の研究は、SCI治療介入の潜在的な標的の同定につながる可能性がある。この記事では、アフリカ ツメガエル・ラエビス ・オタマジャクシ脊髄切除(畜産、手術、術後ケア、機能テスト評価など)を行う方法について説明します。この傷害法は、細胞、分子、遺伝子のメカニズムを研究することによって脊髄再生のさまざまなステップを解明するために適用でき、SCI後および脊髄再生中の組織学的および機能的進化も可能である。
脊髄損傷(SCI)は、世界中で毎年約250,000~500,000人が罹患している感染症です1。この高い有病率に加えて、SCIは感覚神経および運動神経に影響を及ぼし、損傷部位の下に麻痺を引き起こし、CNSの制御からいくつかの内臓を切断する。CNSの一部である脊髄は再生できず、苦痛の複雑さと関連するすべてのプロセスの完全な理解の欠如のために、機能回復を可能にする効率的な治療法はまだありません。
重度のSCI2,3,4の後に脊髄を再生することができるテレオスト魚類、ウロデレ両生類、およびアヌラン両生類の幼虫期などの非哺乳類生物は、成功した再生事象を支配するプロセスを研究し、哺乳類の再生の失敗を理解するための優れたモデル生物である。この理解は、SCIの新しい治療標的と可能な治療法を開発するための独自の洞察を提供できるため、非常に興味深いものです。
アヌランカエル、アフリカツメガエルは、SCIを研究するための優れたモデル生物です。それはオタマジャクシの段階で優れた再生能力を持ち、変態中に徐々に失われ、再生段階と非再生段階での実験を可能にします3,5。アフリカツメガエル・ラエビス・オタマジャクシのSCIを研究するための確立された傷害方法は、筋肉、脊索、脊髄などの組織を含む尾全体を除去した尾切断からなる6。このアプローチは、再生プロセスの一般的なメカニズムの理解に役立ってきました4,7,8,9,10。
尾部切断には脊髄に加えて複数の組織が関与し、ヒトSCI後に起こることとは異なるため、SCIの研究にはより関連性の高い傷害パラダイムが必要である。私たちは、傷害パラダイム5,12,13,14の包括的な記述を生成するために過去11で使用された研究と、SCI12,13,14,15,16,17,18の研究のためのさまざまな方法に頼ってきました。.脊髄切断後、脊髄の尾部を単離して、RNAおよびタンパク質発現およびハイスループット分析14、19、20、21を行うことができる。さらに、脊髄切除の前または後に、薬物および小分子のセロム内注射、ならびにcDNA、RNA、またはモルホリノのエレクトロポレーションは、SCIの予防または治療、またはSCIおよび脊髄再生後に起こる特定の事象におけるこれらの分子の効果の研究を可能にする13,14。.さらに、傷害の進化および再生過程は、生化学的、分子的、組織学的、および機能的アプローチ12,13,14,17,19,20,21,22,23を用いて、損傷後の異なるタイミングで研究することができる。
最後に、前述のすべての技術は非再生段階で使用でき、SCIを研究するためのモデル生物としてアフリカツメガエル・ラエビスを使用することの最も重要な利点の1つ、同じ種における再生および非再生メカニズムの比較研究13,19,20,21,22。この論文は、アフリカツメガエル・ラエビス・オタマジャクシ脊髄切断のためのプロトコルを提示し、再生ニュークープおよびフェイバー(NF)ステージ50オタマジャクシのステージングと選択から始まる。これに続いて、偽およびトランスエクト動物を産生するための脊髄手術、術後ケア、および最後に自由オタマジャクシ遊泳距離の測定による機能回復の分析の手順の説明が続く。
本明細書に記載されるプロトコルは、SCIを実行し、機能回復を評価するための優れた方法である。再現性のためには、健康なオタマジャクシを成長させ、サイズが似ている動物を選ぶことが不可欠です。適切な摂食の欠如は栄養ストレスを引き起こし、その結果、再生能力が低下します26。したがって、オタマジャクシの餌やりには特別な注意を払う必要があります。オタマジャクシは3〜4週間後にステージ50に達すると、成長プロセスを加速するためにより高い温度で飼育することができ、18〜25°Cが最適です27。動物は水の状態や化学製品に敏感であるため、水質は重要です。最適な水条件には、pH(6.5-7.5)、塩化物(<0.02 mg/L)、水の導電率(1.0 mS/cm ± 0.1 単位)、銅(<0.3 mg/L)の炭素ろ過された塩素を含まない水の使用が含まれます。炭酸塩硬度(KH:5-10dKH);一般的な硬度(GH:6-16 dGH);硝酸塩 (NO3: <20 ミリグラム/リットル);亜硝酸塩(NO2:<0.1 mg/L)14,27,28。さらに、汚染を避けるために、プラスチックタンクは、動物を飼育するために週に1回、または手術後1日おきに、塩化物を含まない水とスポンジで徹底的に洗浄する必要があります。洗剤は避けなければなりません。
手術後の生存率を向上させるために、オタマジャクシは長期間(2分以内)麻酔にさらしてはなりません。さらに、一度に1匹のオタマジャクシを麻酔することをお勧めします。動物は水分補給を続ける必要があるので、手術の前後に動物を常に溶液に浸したままにし、手術を始める前にオタマジャクシの上にスプーンで溶液を注ぎます。損傷が脊髄全体を覆うのに十分なほど広範囲であるが、機能回復不良または死を誘発する可能性があるため、広すぎないようにしてください。脊索が損傷すると、動物は曲がり、機能回復が影響を受けます。損傷が脊索を超えて広がると、死亡の確率が高まります14。水泳アッセイ中、ソフトウェアが青い影で各動物を識別する場合、記録は正しいと見なされます。それ以外の場合は、記録を繰り返す必要があります。記録ミスを防ぐために、記録プロセス中に動きや空気や光の変化を避けることが重要です。
脊髄の損傷と再生の根底にある細胞および分子のメカニズムについては、まだ多くの未解決の疑問があります。この研究で説明されているプロトコルは、水泳能力を測定することによって決定された、機能回復に対する異なる細胞事象、遺伝子発現、および治療の寄与を研究するために使用することができる。さらに、他の多くの技術を手術動物に適用することができる。脊髄を単離してタンパク質および/またはmRNA抽出14を行い、損傷および治療後のタンパク質および遺伝子発現プロファイルを研究することができます19,20。この手術はまた、脊髄細胞応答22と脊髄損傷後の神経幹前駆細胞12,13,22の挙動を研究するための基礎でもあった。脊髄再生に関与するシグナル伝達カスケードもまた、本明細書に記載の脊髄損傷パラダイムを用いて研究されている23。要約すると、ここで記載されるプロトコールは、脊髄損傷および再生を研究するための優れたモデルであり、主題に関する既存の知識に貢献してきた多くの研究に使用されてきた。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、PG Slater: FONDECYT N° 3190820からの研究助成金によって資金提供されました。J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
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Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
HEPES | Gibco | 11344-041 | |
Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
KCl | Merck Millipore | 104936 | |
LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pH meter | |||
Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
Sterilized gauze | |||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
Tablespoon | |||
Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |