レンチウイルスshRNAのプールを用いたハイスループットRNA干渉(RNAi)スクリーニングは、悪性腫瘍における治療上重要な合成致死的標的を検出するためのツールとなり得る。我々は、急性骨髄性白血病(AML)におけるエピジェネティックなエフェクターを調査するために、プールされたshRNAスクリーニングアプローチを提供する。
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この記事について
サマリー
要約
急性骨髄性白血病(AML)患者の耐性を回避し、生存率を改善する方法を解明するためには、後天性化学抵抗性の臨床的に関連するドライバーメカニズムを理解することが不可欠です。化学療法を生き延びた白血病細胞のごく一部は、化学療法的侮辱に耐えうるエピジェネティックな状態にある。化学療法へのさらなる曝露は、これらの薬物持続細胞が固定エピジェネティック状態を達成することを可能にし、これは遺伝子発現の変化をもたらし、これらの薬物耐性集団の増殖をもたらし、最終的には再発または難治性疾患をもたらす。したがって、薬剤耐性白血病細胞の生存を必要とするエピジェネティックな変調を同定することは極めて重要である。我々は、ヌクレオシド類似体シタラビン(AraC)に対する耐性を媒介するエピジェネティックモジュレーターを同定するためのプロトコルを、獲得シタラビン耐性AML細胞株におけるプールされたshRNAライブラリースクリーニングを用いて詳述する。このライブラリーは、407のヒトエピジェネティック因子を標的とする5,485のshRNAコンストラクトで構成されており、ハイスループットのエピジェネティック因子スクリーニングを可能にします。
概要
急性骨髄性白血病(AML)の治療選択肢は、シタラビン(AraC)とアントラサイクリンをこの疾患を治療するための礎石として、過去50年近く変わっていません。AML療法の成功に対する課題の1つは、化学療法に対する白血病幹細胞の耐性であり、疾患の再発につながる1,2。エピジェネティックな調節は、がんの病因および薬剤耐性において重要な役割を果たしており、いくつかのエピジェネティックな因子が有望な治療標的として浮上している3,4,5。エピジェネティックな調節機構は、化学療法薬への継続的な曝露下での増殖および生存に影響を及ぼす。非血液学的悪性腫瘍における研究は、薬物効果を克服する細胞のごく一部が様々なエピジェネティクス修飾を受け、それらの細胞の生存をもたらすことを報告している6,7。しかしながら、AMLにおけるシタラビンに対する後天性耐性を媒介するエピジェネティック因子の役割は、探求されていない。
ハイスループットスクリーニングは、時間の経過とともに世界的に重要性を増して....
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プロトコル
インスティテューショナルバイオセーフティ委員会(IBSC)のガイドラインに従い、レンチウイルス(BSL-2)を処理するために適切な施設を使用してください。担当者は、レンチウイルスの取り扱いと処分について適切な訓練を受けるべきです。このプロトコルは、クリスチャン医科大学、ヴェローレのバイオセーフティガイドラインに従います。
1. shRNAの持続的かつ長期発現を得るための最も強力なプロモーターの選択
注:蛍光タンパク質を発現する異なるプロモーターを有するレンチウイルスベクターを用いて形質導入実験を行い、実験用に選択された細胞株においてshRNAsの安定的かつ長期発現を提供するプロモーターを同定することが不可欠である。この目的のために最も一般的に使用されるプロモーターは、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するhEF1α(ヒト伸長因子1α)、hCMV(ヒトサイトメガロウイルス)、およびSSFV(脾臓焦点形成ウイルス)プロモーターである(図2A)。
- トリパンブルー排除法を用いて細胞数を行う。MV4-11 AraC R細胞を、8μg/mLポリブレンを含む10%RPMI培地(100U/mLペニシリンおよび100U/mLストレプトマイシンを添加した10%FBSを含むRPMI)に懸濁する。6 ウェルプレ....
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結果
スクリーニングワークフロー全体を図1Aに示します。MV4−11 AraC Rのインビトロ細胞傷害性(48時間)は、MV4−11 AraC R中のシタラビンに対するIC50がMV4−11 Pよりも高いことを明らかにした(図1B)。この細胞株を、シタラビン耐性の原因となるエピジェネティック因子をスクリーニングするためのモデルとして研究に使用した。
図2A は、hEF1α(ヒト伸長因子1α)、hCMV(ヒトサイトメガロウイルス)、SSFV(脾臓焦点形成ウイルス)の3つの異なるプロモーターを用いた線状化pZIPベクターマップを示し、UltramiR配列内にスクランブルされたshRNAを有する。 図2B は、ライブラリ実験で用いたpZIPベクターマップと、hEF1aプロモーターによって駆動される選択マーカ.......
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ディスカッション
RNA干渉(RNAi)は、siRNAおよびshRNAスクリーニングを含む機能ゲノミクス研究に広く使用されている。shRNAの利点は、それらをプラスミドベクターに組み込んでゲノムDNAに組み込むことができ、安定した発現をもたらし、したがって標的mRNAのより長期のノックダウンをもたらすことである。プールされたshRNAライブラリースクリーニングは、従来のアレイスクリーニング(siRNA)と比較して堅牢で費用対効果が高い。ゲノムワイドスクリーンで特定のクラスのタンパク質の本質を特定することは、面倒な作業です。標的スクリーニングアプローチは、特定のクラス内の癌細胞の生存または薬剤耐性に対する個々のタンパク質の本質的な性質を、ノイズを低減して明らかにすることができる。このプロトコルは、必須遺伝子と非必須遺伝子の両方を体系的に調べるためのエピジェネティック因子のRNAiスクリーニングを強調し、AML薬剤耐性の原因となる標的の同定を可能にする機能的プラットフォームとしてのこのアプローチの使用を実証する。
この強力な技術は、実験の設計と実行において一定の予防措置を必要とします。第1は、shRNA.......
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開示事項
著者には利益相反はなく、開示するものもありません。
謝辞
この研究は、バイオテクノロジー省の助成金BT / PR8742 / AGR / 36 / 773 / 2013からSRVへの資金提供を受けています。インドバイオテクノロジー省BT/COE/34/SP13432/2015およびインド科学技術省:EMR/2017/003880からP.B. RVSおよびP.B.は、それぞれWellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118およびIA/S/15/1/501842によってサポートされています。S.D.はCSIR-UGCフェローシップによって支援され、S.I.はICMRシニアリサーチフェローシップによってサポートされています。Abhirup Bagchi、Sandya Rani、CSCR Flow Cytometry Core Facilityのスタッフの協力に感謝します。また、ハイスループットシーケンシングとデータ解析を支援してくれたMedGenome Inc.にも感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| 100 bp ラダー ハイパーラダー | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb ラダー ハイパーラダー | BIOLINE | BIO-33056 | |
| アガロース | ロンザ Seachekm | 50004 | |
| ベタイン (5mM) | シグマ | B03001VL | |
| ホウ酸 | クオリゲン | 12005 | |
| 細胞培養プラスチック製品 | コーニング | 適性 | |
| シトシン &β;-D-アラビノフラノシド塩酸塩 | Σ | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | ||
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Σ | E5134 | |
| 臭化 | エチジウムSigma | E1510-10 mL | |
| ウシ胎児血清 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 16000044 | |
| ゲル/PCR 精製キット | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | サイエン | |
| 氷酢酸 | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP プラスミド | トランスオミクス トランスオミクス プロモーター選択キット | ||
| hEF1a GFPlasmid | トランスオ | ミクス トランスオミクス プロモーター選択キット | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60細胞株 | ATCC | CCL-240 | |
| KOD ホットスタートポリメラーゼ | Merck | 71086 | |
| Molm13細胞株 | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | ||
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| 15140122 psPAX2 および pMD2.G | Addgene | Addgene プラスミド no.12260 &Addgene プラスミド no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No.TLH UD7409;ロット番号:A116。V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus Mirus | カタログ番号: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra 遠心分離管 | ベックマン・コールター | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2インキュベータ | サーモフィッシャーBD | ||
| Aria III細胞選別機 | ベクトン・ディキンソン | ||
| ベックマン・コールター オプティマL-100K-超遠心分離 | 機 ベックマン・コールター | ||
| 遠心分離 | 機 サーモマルチージ 3SR+ | ||
| ChemiDocイメージングシステム (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
参考文献
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(201....
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再版と許可
