本プロトコールでは、フルオロフォアアシスト炭水化物電気泳動(FACE)技術を用いて、グリコーゲンの鎖長分布(CLD)および平均鎖長(ACL)を決定しています。
グリコーゲン粒子は、直鎖状のグルコシル単位がα-1,4-グルコシド結合により結合したものからなる分岐多糖類である。後者は、α-1,6−グルコシド結合によって互いに結合しており、分岐点と呼ばれる。炭素貯蔵のさまざまな形態(すなわち 、デンプン、βグルカン)の中で、グリコーゲンはおそらく生きている世界で見られる最も古く、最も成功した貯蔵多糖類の1つです。グルカン鎖は、必要に応じて大量のグルコースを細胞内で迅速に貯蔵または燃料供給できるように組織化されている。グリコーゲン粒子の微細構造を解決するために、過去数十年にわたって多数の相補的技術が開発されてきた。この記事では、蛍光色素支援炭水化物電気泳動 (FACE) について説明します。この方法は、グリコーゲン粒子を構成するグルカン鎖の集団を定量する。鎖長分布 (CLD) とも呼ばれるこのパラメーターは、粒子サイズと分岐の割合を反映します。また、グリコーゲン生合成の数学的モデリングにも不可欠な要件です。
炭素およびエネルギー貯蔵として使用されるグリコーゲンは、(1→4)-グリコシル結合によって結合され、(1 α 6)-→グリコシド結合または分岐点を介して結合したグルコシル単位の直鎖からなるグルコースのホモポリマー αある。それらは、広範囲の生物の細胞質ゾル中のβ粒子およびα粒子として現れる。β粒子は、主に原核生物で観察される小さな水溶性粒子である。それらの直径は20〜40nmの範囲であり、グリコーゲン代謝酵素および立体障害によって決定される可能性が高い1,2。
動物細胞で最初に説明した、より大きなα粒子はカリフラワーのような形状で直径300nmまで表示します。この特定の組織は、いくつかのβ粒子の凝集に由来するか、または単一のβ粒子3から出芽することによって生じ得る。興味深いことに、最近の研究では、エシェリヒア・コリ4にα粒子が存在することが報告されています。しかし、動物細胞からのα粒子とは異なり、後者は抽出プロセス中に迅速に崩壊し、これは文献4のデータの欠如を説明する可能性がある。真核生物および原核生物におけるα粒子の出現は、系統学的に無関係なグリコーゲン代謝酵素5を含む。これは、そのような粒子の機能およびβ粒子5間の潜在的な架橋剤の性質に関する疑問を提起する。
グリコーゲン分子形成6、7、8、9については2つの相反する数学的モデルが提案されているが、β粒子は、大量のグルコースの迅速な放出のための高効率燃料貯蔵庫としての代謝機能に応答して進化してきたことが一般に受け入れられている。大量の証拠は、消化率や水への溶解度などのグリコーゲン特性が平均鎖長(ACL)と相関していることを示しており、分岐点の割合と粒子サイズ2、6、7、8、10、11を決定します。.ACLは、グルコース残基の総数と分岐点の数との間の比率によって定義される。典型的には、ACL値は、真核生物および原核生物におけるグルコース残基の11〜14および7〜23からそれぞれ10まで変化する。ヒトにおいて、いくつかのグリコーゲン障害疾患は、異常なグリコーゲン蓄積によるものである。例えば、アンデルセン病はグリコーゲン分岐酵素の欠損活性と関連しており、異常なグリコーゲン11の蓄積をもたらす。原核生物では、累積的な研究により、ACLがグリコーゲンの分解速度および細菌生存能力に影響を与える重要な因子であることを示唆している12,13。ACL値の低いβ粒子を合成する細菌は、よりゆっくりと分解するため、飢餓状態に耐えることが報告されています。したがって、β粒子の構造に関する知識は、ヒトグリコーゲン貯蔵疾患における異常なグリコーゲン粒子の形成および栄養欠乏環境における原核生物の生存を理解するために不可欠である。
19世紀後半にフランスの生理学者クロード・ベルナールがイヌの肝臓からグリコーゲンを初めて単離して以来、グリコーゲン粒子を詳細に特徴付けるために多くの技術が開発されました。例えば、グリコーゲン形態(α粒子またはβ粒子)15のための透過型電子顕微鏡、α-1,6結合16の割合を決定するためのプロトンNMR分析、分子量を推測するためのマルチディテクタを備えたサイズ排除クロマトグラフィー、フルオロフォアアシスト炭水化物電気泳動(FACE)17 、または鎖長分布(CLD)とACLの両方のためのパルスアンペロメトリック検出(HPAEC-PAD)による高速陰イオン交換クロマトグラフィー 決定18.
この研究は、第一級アミン機能によるヘミアセタール基の還元的アミノ化に依存する蛍光色素支援炭水化物電気泳動法に焦点を当てています。歴史的に、8-アミノ-1,3,6-ナフタレントリスルホン酸(ANTS)が最初に標識に使用されました。その後、より高感度な蛍光色素である8-アミノ-1,3,6-ピレントリスルホン酸(APTS)19に置換した。
図1:8-アミノ-1,3,6-ピレントリスルホン酸(APTS)との還元的アミノ化反応。還元的条件下での8-アミノ-1,3,6-ピレントリスルホン酸(APTS)の1級アミン機能によるヘミアセタール基の還元的アミノ化反応この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
図1に描かれているように、グルカン鎖の還元末端のヘミアセタール機能は、還元条件下でAPTSの第1級アミンと相互作用する。APTSのスルホン基は、重合度(DP)に応じてグルカン鎖の分離を可能にする負電荷を帯びる。還元性アミン反応は、再現性が高く、効率的である。DP3〜DP135については80%、マルトース(DP2)およびグルコースについてはそれぞれ88%および97%までの平均効率標識が得られ、それぞれ17,20である。APTSの1分子は各グルカン鎖の還元末端と反応するため、個々の鎖を定量し、モルベースで互いに比較することができた。
グリコーゲン粒子の物理化学的特性(例えば、サイズ、形態、溶解度)は、粒子を構成するグルカンの長さに直接関連している。生合成酵素と異化酵素との間の任意の不均衡は、鎖長分布の変化をもたらし、 それ自体、 細胞11にとって有害であり得る異常なグリコーゲンの蓄積をもたらす。FACE分析は、グリコーゲンの鎖長分布(CLD)を決定するために選択される方法です。 図2に示されているように、CLDの決定は、グリコーゲン粒子の構造を反映するグリコーゲン(ACL)の平均鎖長値の推論を可能にする。高いACL値を有する動物グリコーゲンは、異常な粒子の出現と関連している。サブトラクティブ分析は、異なる遺伝的背景(変異型と野生型)からの2つのグリコーゲンサンプルを比較するのに役立つ方法です。一方、最大ピークまで正規化されたCLDsを対数スケールでプロットすることにより、CLDを基準とは無関係に比較できるという利点があり、グリコーゲンの増殖メカニズムに関する情報が得られました。
さらに、FACE分析は、グリコーゲン代謝酵素の触媒特性を特徴付けるための強力な技術です。例えば、すべてのグリコーゲン分岐酵素は、(1→4)-α結合を切断し、オリゴマルトシル基を(1→6)-α位置または分岐点に転移する。分岐酵素は、類似の触媒機構22にもかかわらず、多糖類(例えば、アミロペクチン、グリコーゲン)および移されたグルカンの長さに対するそれらの親和性のために区別可能である。したがって、枝分かれ酵素の様々な供給源(ヒト、植物、細菌)を、一連のインキュベーション実験およびFACE分析23を用いたCLD比較を通して特徴付けおよび分類することができる。
序文で述べたように、HPAEC−PADはまた、鎖長分布18を決定するための代替方法でもある。どちらの技術も、重合度(DP)に応じて直鎖状グルカンのプールを分離する前に、イソアミラーゼ型分岐酵素による(1→6)-α結合または分岐点の完全な加水分解を必要とする。しかし、HPAEC−PAD法には、FACEと比較して2つの欠点がある:(1)グルカン鎖が増加するにつれてアンペロメトリックパルス応答が低下し、定量的情報を提供しない。この質量バイアスの問題は、陰イオン交換カラムとPAD24の間のポストカラム酵素反応器を含むHPAEC−ENZ-PADを使用して回避することができる。カラム酵素反応器は、マルトオリゴ糖をグルコース残基に加水分解し、一定のパルスアンペロメトリック応答を可能にします。(2)HPAEC−PADは、重合度が70までのグルカン鎖の分離を可能にする。グリコーゲンサンプルのCLDを決定するには分解能で十分ですが、FACEはデンプンサンプルに適した最大150のDPで鎖を分離します17。HPAEC-PADとFACE分析の両方に長所と短所があることに留意することが不可欠です。例えば、アミノ化反応は、APTSの第1級アミン機能と反応するために遊離ヘミアセタール基を必要とする。これは、APTS標識が還元末端を欠くグルカン鎖(例えば、イヌリン)には使用できないことを意味する。HPAEC−PAD法は、還元末端の存在を必要としない。HPAEC−PAD法の第2の興味深い側面は、陰イオン交換カラムに数ミリグラムの直鎖状グルカンを装填することができ、酵素アッセイのために特定のDPまたは14C放射性標識マルトオリゴ糖を有するマルトオリゴ糖の精製を可能にすることである18,25。最後に、質量分析(例えば、MALDI−TOF)は、鎖長分布を決定するための高速かつ高感度な技術であるが、この技術は再現性が低いようである。長グルカン鎖26の量を過大評価する。それにもかかわらず、後者は、細胞組織全体にわたるグリコーゲンの存在をマッピングするためのMALDI画像化などの特定の用途に使用することができる27。
The authors have nothing to disclose.
この研究はCNRS、リール大学CNRS、ANR助成金「MathTest」(ANR-18-CE13-0027)によって支援されました。
AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |